三種木腐菌木材降解相關(guān)酶以及相關(guān)基因TRAP標記的變異.pdf

1、本研究以黑龍江省東北林業(yè)大學帽兒山實驗林場的3種典型木材腐朽菌為實驗材料,包括樺剝管菌一種褐腐菌,木蹄層孔菌和彩絨革蓋菌兩種白腐菌,以其木質(zhì)素降解相關(guān)酶類為主要研究對象,比較3種木材腐朽菌的LiP、MnP、Lac在不同培養(yǎng)條件下的生理特性;并且采用TRAP分子標記的手段,篩選LiP、MnP、Lac、CBHⅡ、CDH編碼基因的引物,分析這些編碼基因的多態(tài)性,證明TRAP分子標記可以應(yīng)用于木腐菌的遺傳分析。
　　 常溫條件下,彩絨革

2、蓋菌表達3種木質(zhì)素相關(guān)酶的能力明顯高于樺剝管菌和木蹄層孔菌。不同木腐菌的木質(zhì)素降解相關(guān)酶的表達受各種因素的影響情況各不相同。HCLN培養(yǎng)基對3種木腐菌LiP的表達都有促進作用,LCHN培養(yǎng)基對3種木腐菌MnP的表達都有所促進,HCLN培養(yǎng)基能夠在培養(yǎng)早期促進3種木腐菌Lac的表達,而HCHN條件能夠在木蹄層孔菌生長的后期促進其表達lac。3種木腐菌表達木質(zhì)素降解相關(guān)酶的最適pH不同,樺剝管菌和木蹄層孔菌表達LiP的最適pH為5.0,而彩

3、絨革蓋菌表達LiP的最適pa為4.5。偏酸和偏堿條件在一段時間內(nèi)對3種木腐菌MnP的表達有明顯的促進作用。樺剝管菌表達Lac的最適pH是4.5,彩絨革蓋菌表達Lac的最適pH為5.5,而木蹄層孔菌在pH為6.5時Lac的表達量最多。適當增加的Mn2+濃度對3種木腐菌LiP的表達有抑制作用。對于木蹄層孔菌和彩絨革蓋菌,MnP活性隨 Mn2+濃度的增加而增加,當Mn2+＞1.25mmol/L時MnP活性隨濃度的增加而降低。Mn2+濃度的增加

4、抑制樺剝管菌表達Lac,促進木蹄層孔菌表達Lac,而對彩絨革蓋菌Lac的表達未起到明顯影響。熱激條件抑制3種木腐菌表達LiP和Lac;促進MnP的表達。
　　 實驗改良了CTAB法提取3種木腐菌的基因組DNA的方法。確定了3種木腐菌TRAP分子標記的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。TRAP-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為:總體積20μL,DNA模板2.0μL(約100ng),固定引物(10μM)2.0μL,隨機引物(10μM)2.0μL,dNTP(

5、20mM)2.0μL,MgCl2(25mM)2.0μL,1×buffer2.0μ L,Taq酶0.15μ L,去離子水7.85μL。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5個循環(huán);94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,35個循環(huán);72℃延伸7min;4℃保存。經(jīng)過對32對引物進行篩選試驗,共確定11對引物,包括3對標記MnP編碼基因的引物、3對標記Lac編