三種菌ampG基因的結(jié)構(gòu)及遺傳互補功能研究.pdf

1、目的:
　　 通過對霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的ampG基因參考序列和AmpG蛋白參考序列的整理，預測和分析其AmpG蛋白序列的保守位點和跨膜片段，探討不同菌屬AmpG蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性。將銅綠假單胞菌的ampG基因敲除，用鮑曼不動桿菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌的ampG基因進行回補，通過比較回補前后菌屬的表型改變，來研究不同菌屬ampG基因的編碼產(chǎn)物對AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的調(diào)控作用，從而為研制能抑制AmpG轉(zhuǎn)運蛋白功能的

2、藥物和臨床選擇用藥提供新的思路。
　　 方法:
　　 在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的ampG基因序列和AmpG蛋白序列，進行序列的對比分析，并對AmpG蛋白序列保守位點和跨膜區(qū)進行預測，分析AmpG蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性。用PCR技術(shù)擴增鮑曼不動桿菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌的ampG基因，再進行分子克隆。通過基因回補實驗，將三種細菌的ampG基因分別回補到銅綠假單胞菌（敲除了ampG基因）中。測定

3、回補前后細菌AmpG蛋白表達量、Amp耐藥濃度和AmpC酶的酶活性，通過對比，分析ampG基因的水平轉(zhuǎn)移和變異規(guī)律，以及不同菌屬來源的ampG基因?qū)Ξa(chǎn)AmpC酶系統(tǒng)的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:
　　 1搜索到霍亂弧菌的57條AmpG蛋白序列，4條ampG基因序列，鮑曼不動桿菌13條AmpG蛋白序列，3條ampG基因序列，銅綠假單胞菌PA01的5條AmpG蛋白序列，2條ampG基因序列，通過對比分析和整理各得到一條參考序列。

4、
　　 2將霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌AmpG氨基酸參考序列分別與銅綠假單胞菌PA01(PA4393)進行比對，發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌與銅綠假單胞菌PA01(PA4393) AmpG氨基酸序列相似度為75％，而鮑曼不動桿菌與銅綠假單胞菌PA01(PA4393) AmpG氨基酸序列相似度為64％。
　　 3用PRED-TMR軟件分別對霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌PA01的AmpG蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)分析。分析結(jié)果表明，霍亂弧菌的Am

5、pG蛋白有10個跨膜片段，而鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌PA01的AmpG蛋白分別有11，13個跨膜片段。
　　 4在基因回補實驗中，用霍亂弧菌ampG基因回補到敲除了ampG基因的銅綠假單胞菌PA01后，Amp-MIC值由回補前的64μg/ml升為512μg/ml，用鮑曼不動桿菌ampG基因回補后，Amp-MIC值由64μg/ml升為1024μg/ml，用銅綠假單胞菌的ampG基因回補后，Amp-MIC值由64μg/ml升為10

6、24μg/ml。
　　 5在AmpC酶的誘導實驗中，敲除了ampG基因的銅綠假單胞菌PA01用抗生素誘導后AmpC酶的酶活性由誘導前的35.49只升到44.82。而未敲除ampG基因的銅綠假單胞菌PA01AmpC酶的酶活性由誘導前的112.4升到1981.64，用霍亂弧菌的ampG基因回補后，AmpC酶的酶活性從誘導前的24.4升到5063.64，用鮑曼不動桿菌的ampG基因回補后，AmpC酶的酶活性從誘導前的49.48升到68

7、00.35，用銅綠假單胞菌的ampG基因回補后，AmpC酶的酶活性從誘導前的37.87升到5019.31。
　　 結(jié)論:
　　 通過對霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌PA01的AmpG蛋白序列的對比分析，發(fā)現(xiàn)不同菌屬的AmpG蛋白序列和跨膜片段不完全相同，具有多態(tài)性。但AmpG蛋白作為一種跨膜蛋白，其氨基酸序列具有一定的相似性，有一些相同的疏水性氨基酸的保守位點，這說明不同菌屬的AmpG蛋白雖然有多態(tài)性，但其結(jié)構(gòu)和跨