甜瓜APX和Mlo基因的克隆與功能分析.pdf

1、甜瓜是重要的瓜類作物，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。近年來，甜瓜白粉病逐漸成為栽培中的主要病害，在露地以及保護地生產(chǎn)條件下，發(fā)病后均可導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)，品質(zhì)下降。常見病原菌主要為瓜單絲殼屬白粉菌和二孢白粉菌，瓜單絲殼白粉菌的危害性要大于二孢白粉菌。生產(chǎn)上主要通過常規(guī)雜交選育的方法，培育甜瓜抗白粉病品種，但是由于白粉病原菌生理小種的演替速度很快，所以抗病育種往往落后于小種更替。施用化學(xué)殺菌劑是目前防控白粉病的主要手段，但又往往損傷了葉片和帶來了污染。

2、因此，通過基因工程，創(chuàng)造廣譜抗白粉病的甜瓜種質(zhì)具有非常重要的意義。 本研究從甜瓜中克隆到APX和Mlo家族基因，研究了各基因在白粉病脅迫條件的表達，發(fā)現(xiàn)APX和CmMlo家族基因在白粉病發(fā)病過程中具有一定的相關(guān)性，其中CmMlo2在白粉病發(fā)病過程中具有重要作用，可能參與了白粉病抗性機制的負調(diào)控過程，缺失Mlo會降低白粉病入侵的門檻。將CmMlo2構(gòu)建了RNA干擾載體，轉(zhuǎn)化甜瓜，獲得了抗白粉病的To代轉(zhuǎn)基因植株，實驗取得的主要結(jié)果

3、如下： 1.利用同源序列設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR方法從甜瓜葉片中克隆到抗壞血酸過氧化物酶APX基因的中間片段，再通過5'RACE和3'RACE分別克隆得到5'端片段和3'端片段，拼接后設(shè)計特異引物擴增到全長1012bp cDNA，ORF為750bp，編碼249個氨基酸的多肽，分子量大約為27.3kDa。同源序列比對表明，甜瓜APX基因和黃瓜、番茄、玉米、小麥、大麥、擬南芥等APX基因高度同源，將該基因命名為CmAPX，Ge

4、nBank登錄號：EF693949。根據(jù)獲得的cDNA序列，設(shè)計引物，從基因組擴增得到甜瓜APX的gDNA序列，與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)CmAPX包含10個外顯子，9個內(nèi)含子，所有內(nèi)含子均符合GT-AG剪切規(guī)則。 2.構(gòu)建了pET24-CmAPX原核表達載體，誘導(dǎo)1、2、3、4、5h后蛋白表達量分別占總?cè)诤系鞍椎?0％、47.5％、50.6％、51.7％、51.6％。表明CmAPX基因在pET24a(+)載體中獲得高效表達。表達產(chǎn)

5、物具有APX酶活性，說明CmAPX編碼抗壞血酸過氧化物酶基因。 3.通過RT-PCR半定量，甜瓜APX基因在不同器官中呈非特異性表達，在葉片中的mRNA含量明顯高于根、莖，花及果實。經(jīng)白粉病誘導(dǎo)0、1、3、5、7d后，表達量在5d時達到最高值，和葉片中酶活性變化一致，表明CmAPX可能參與了白粉病生物脅迫過程。 4.根據(jù)大麥、擬南芥等Mlo基因的保守序列，設(shè)計兼并引物，擴增得到了3個甜瓜Mlo類似中間片段，進一步通過Ra

6、ce技術(shù)，獲得了3個cDNA全長，分別命名為CmMlo1，CmMlo2和CmMlo3。其中CmMlo1全長1551bp，編碼516個氨基酸；CmMlo2全長1713bp，編碼570個氨基酸：CmMlo3全長1464bp，編碼487個氨基酸.序列比對結(jié)果表明，CmMlo屬于基因家族，和擬南芥的Mlo基因同源性在70％左右。定量和半定量分析結(jié)果表明，CmMlo在甜瓜組織中呈特異性表達，在受到白粉病脅迫條件下，CmMlo2表達量上調(diào)，CmMl

7、o2可能參與了白粉病發(fā)病的負調(diào)控過程。 5.跨膜蛋白預(yù)測表明，CmMlo2為跨膜蛋白。具有7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。構(gòu)建pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白并轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，結(jié)果表明，CmMlo2蛋白定位于細胞膜。將pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)化煙草，野生型煙草出現(xiàn)了熒光，構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)pFGC1008-CmMlo2干擾載體，轉(zhuǎn)入熒光煙草可以導(dǎo)致熒光消失，表明干擾載體對靶序列是有效的。 6.建立了穩(wěn)定高效的甜瓜再生