2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、甜瓜是重要的瓜類作物,在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。近年來,甜瓜白粉病逐漸成為栽培中的主要病害,在露地以及保護地生產(chǎn)條件下,發(fā)病后均可導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn),品質(zhì)下降。常見病原菌主要為瓜單絲殼屬白粉菌和二孢白粉菌,瓜單絲殼白粉菌的危害性要大于二孢白粉菌。生產(chǎn)上主要通過常規(guī)雜交選育的方法,培育甜瓜抗白粉病品種,但是由于白粉病原菌生理小種的演替速度很快,所以抗病育種往往落后于小種更替。施用化學(xué)殺菌劑是目前防控白粉病的主要手段,但又往往損傷了葉片和帶來了污染。

2、因此,通過基因工程,創(chuàng)造廣譜抗白粉病的甜瓜種質(zhì)具有非常重要的意義。 本研究從甜瓜中克隆到APX和Mlo家族基因,研究了各基因在白粉病脅迫條件的表達,發(fā)現(xiàn)APX和CmMlo家族基因在白粉病發(fā)病過程中具有一定的相關(guān)性,其中CmMlo2在白粉病發(fā)病過程中具有重要作用,可能參與了白粉病抗性機制的負調(diào)控過程,缺失Mlo會降低白粉病入侵的門檻。將CmMlo2構(gòu)建了RNA干擾載體,轉(zhuǎn)化甜瓜,獲得了抗白粉病的To代轉(zhuǎn)基因植株,實驗取得的主要結(jié)果

3、如下: 1.利用同源序列設(shè)計兼并引物,通過RT-PCR方法從甜瓜葉片中克隆到抗壞血酸過氧化物酶APX基因的中間片段,再通過5'RACE和3'RACE分別克隆得到5'端片段和3'端片段,拼接后設(shè)計特異引物擴增到全長1012bp cDNA,ORF為750bp,編碼249個氨基酸的多肽,分子量大約為27.3kDa。同源序列比對表明,甜瓜APX基因和黃瓜、番茄、玉米、小麥、大麥、擬南芥等APX基因高度同源,將該基因命名為CmAPX,Ge

4、nBank登錄號:EF693949。根據(jù)獲得的cDNA序列,設(shè)計引物,從基因組擴增得到甜瓜APX的gDNA序列,與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)CmAPX包含10個外顯子,9個內(nèi)含子,所有內(nèi)含子均符合GT-AG剪切規(guī)則。 2.構(gòu)建了pET24-CmAPX原核表達載體,誘導(dǎo)1、2、3、4、5h后蛋白表達量分別占總?cè)诤系鞍椎?0%、47.5%、50.6%、51.7%、51.6%。表明CmAPX基因在pET24a(+)載體中獲得高效表達。表達產(chǎn)

5、物具有APX酶活性,說明CmAPX編碼抗壞血酸過氧化物酶基因。 3.通過RT-PCR半定量,甜瓜APX基因在不同器官中呈非特異性表達,在葉片中的mRNA含量明顯高于根、莖,花及果實。經(jīng)白粉病誘導(dǎo)0、1、3、5、7d后,表達量在5d時達到最高值,和葉片中酶活性變化一致,表明CmAPX可能參與了白粉病生物脅迫過程。 4.根據(jù)大麥、擬南芥等Mlo基因的保守序列,設(shè)計兼并引物,擴增得到了3個甜瓜Mlo類似中間片段,進一步通過Ra

6、ce技術(shù),獲得了3個cDNA全長,分別命名為CmMlo1,CmMlo2和CmMlo3。其中CmMlo1全長1551bp,編碼516個氨基酸;CmMlo2全長1713bp,編碼570個氨基酸:CmMlo3全長1464bp,編碼487個氨基酸.序列比對結(jié)果表明,CmMlo屬于基因家族,和擬南芥的Mlo基因同源性在70%左右。定量和半定量分析結(jié)果表明,CmMlo在甜瓜組織中呈特異性表達,在受到白粉病脅迫條件下,CmMlo2表達量上調(diào),CmMl

7、o2可能參與了白粉病發(fā)病的負調(diào)控過程。 5.跨膜蛋白預(yù)測表明,CmMlo2為跨膜蛋白。具有7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。構(gòu)建pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白并轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞,結(jié)果表明,CmMlo2蛋白定位于細胞膜。將pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)化煙草,野生型煙草出現(xiàn)了熒光,構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)pFGC1008-CmMlo2干擾載體,轉(zhuǎn)入熒光煙草可以導(dǎo)致熒光消失,表明干擾載體對靶序列是有效的。 6.建立了穩(wěn)定高效的甜瓜再生

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