桃拉綜合征病毒多克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、桃拉綜合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）能感染對蝦引發(fā)桃拉綜合征（TauraSyndrome，TS）。在其主要宿主凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）和細(xì)角對蝦（P.stylirostris）中爆發(fā)流行和導(dǎo)致高死亡率。其核衣殼由三個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白有VP1，VP2和VP3（55，40和24kD）和一個(gè)次要蛋白VP0（58 kD）構(gòu)成，其中VP1基因是關(guān)鍵的抗原基因。本研究對VP1基因全長及保守區(qū)進(jìn)行了克隆

2、表達(dá)，制備了多克隆抗體，并應(yīng)用多克隆抗體初步探討了膠體金免疫層析快速檢測方法。
　　 根據(jù)桃拉病毒中國株ZHZC3的全基因組序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增其主要結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1保守區(qū)及全長的相應(yīng)引物，利用RT-PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，分別獲得了841bp和1552bp的基因片段。再將目的基因與pET-32a（+）載體連接，分別構(gòu)建高效表達(dá)重組載體pET32a-VP1cr、pET32a-VP1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），重組子

3、經(jīng)酶切和測序鑒定正確后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明：融合蛋白在37℃下，1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)下能良好表達(dá)，并且，融合蛋白均以包涵體的形式存在。用鎳柱純化包涵體后能獲得較純的融合蛋白。
　　 融合蛋白pET32a-VP1cr/VP1經(jīng)HisTrapTM HP純化后分別免疫新西蘭家兔和ICR小鼠，制備不同種屬來源的多克隆抗體。通過ELISA方陣試驗(yàn)，確定pET32a-VP1

4、cr融合蛋白免疫新西蘭家兔和ICR小鼠的最佳蛋白包被濃度均為1μg/mL，最佳血清稀釋度分別為1:1600和1:3200；融合蛋白pET32a-VP1免疫新西蘭家兔和ICR小鼠的最佳蛋白包被濃度分別為1μg/mL和2μg/mL，最佳血清稀釋度分別為1:3200和1:12800。方陣滴定后間接ELISA檢測血清效價(jià)，兩種融合蛋白分別免疫ICR小鼠的效價(jià)均達(dá)到1:25600，新西蘭家兔的效價(jià)達(dá)1:102400。用Hitrap Protein

5、 G HP柱純化抗血清獲得較純的IgG。用純化的兔抗融合蛋白IgG與粗提的TSV進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，在55kD位置出現(xiàn)特異性條帶。
　　 分別用20nm和30nm的膠體金標(biāo)記了兔抗pET32a-VP1cr抗體和兔抗pET32a-VP1抗體。采用雙抗體夾心法，用20nm膠體金標(biāo)記兔抗pET32a-VP1cr抗體制成金標(biāo)抗體結(jié)合墊，將鼠抗pET32a-VP1cr抗體噴涂在NC膜組裝成了膠體金免疫層析試紙條。陰性對照檢測