中國合作豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子的克隆及基因結(jié)構(gòu)與多態(tài)性分析.pdf

1、（Major histocopitibility complex，MHC）又稱白細(xì)胞抗原（Lymphocyte Antigen），是集中于某一染色體、編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的一類細(xì)胞膜糖蛋白基因簇，是目前已知的多態(tài)性最豐富的基因系統(tǒng)。MHC不僅控制著機(jī)體移植排斥反應(yīng)，還參與機(jī)體對(duì)內(nèi)/外源性抗原的識(shí)別、結(jié)合，與機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答密切相關(guān)。MHC在人類稱為HLA，在豬則稱為SLA（swine Lymphocyte Antigen），其中SL

2、A Ⅰ類和SLA Ⅱ類是其最重要的經(jīng)典分子。中國合作豬是由野豬通過自然馴化和人工選擇而來的一個(gè)地方豬種，主要分布于甘肅省甘南藏族自治州等高原地區(qū)，是一個(gè)原始地方小型豬種。由于獨(dú)特的高原氣候類型和復(fù)雜多樣的地形地貌特征，加之交通閉塞、地理隔離以及民族特有的經(jīng)濟(jì)、文化活動(dòng)，保存了許多獨(dú)特而優(yōu)秀的遺傳性狀，耐粗飼、耐嚴(yán)寒、抗病力強(qiáng)，其特有的基因型是其他豬種所不具備的，是我國重要的遺傳多樣性基因資源庫。本研究以商品化白豬和GenBank收錄的相

3、關(guān)物種的SLA基因作為比較對(duì)象，重點(diǎn)研究合作豬SLA Ⅰ類和Ⅱ類分子的基因結(jié)構(gòu)及其遺傳多態(tài)性，探討其獨(dú)特的生物學(xué)特性與該類分子的關(guān)系，為抗病基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。取得的研究結(jié)果如下： 1、首次成功地克隆了合作豬和商品化白豬SLAⅠ類（SLA-1、-2和-3）和Ⅱ類（DRA、DRB、DQA和DQB）分子的功能基因及其相應(yīng)的基因組序列，其中SLAⅠ類分子功能基因序列共6個(gè)（GenBank登錄號(hào)為FJ905817～FJ905822），相應(yīng)

4、的基因組序列6個(gè)（GenBank登錄號(hào)為FJ905829～FJ905834）；SLAⅡ類分子功能基因序列共8個(gè)（GenBank登錄號(hào)分別為FJ905823、FJ905824～FJ905828），相應(yīng)的基因組序列7個(gè)（GenBank登錄號(hào)為FJ905835～FJ905840）。 2、系統(tǒng)分析合作豬和商品化白豬SLAⅠ類基因的結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅠ類分子基因可分為五個(gè)功能區(qū)，其多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在α1與α2結(jié)構(gòu)域，其中核苷酸非

5、同義置換位點(diǎn)數(shù)多于同義置換位點(diǎn)數(shù)。SLAⅠ類分子共有21個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中SLA-1有4個(gè)，主要位于α2和α3功能區(qū)；SLA-2有6個(gè)，主要位于α1、α2和α3功能區(qū)；SLA-3有13個(gè)，主要位于α2和α3功能區(qū)。合作豬SLAⅠ類分子共有17個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，而商品化白豬有6個(gè)，說明合作豬的SLAⅠ類分子多態(tài)性高于商品化白豬。 3、系統(tǒng)分析合作豬和商品化白豬SLAⅡ類基因的結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)SLAⅡ類分子基因可分為四個(gè)

6、功能區(qū)，其多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在α1（β1）結(jié)構(gòu)域，其中DRAα1區(qū)僅有一個(gè)非同義置換位點(diǎn)，而DQAα1區(qū)的同義置換位點(diǎn)數(shù)多于非同義置換位點(diǎn)數(shù)；DRB和DQB的β1區(qū)的核苷酸同義置換位點(diǎn)數(shù)少于非同義置換位點(diǎn)數(shù)。SLAⅡ類分子共有23個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中DRA有5個(gè)，主要位于α1區(qū)；DQA有6個(gè)，主要位于α1和α2功能區(qū)；DQB有4個(gè)，主要位于β1區(qū)、信號(hào)肽和穿膜區(qū)及胞漿區(qū)；DRB有7個(gè)，主要位于β1、β2區(qū)和穿膜區(qū)及胞漿區(qū)。合作豬SL

7、AⅡ類分子共有9個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，而商品化白豬共有13個(gè)，說明商品化白豬SLAⅡ類分子的多態(tài)性高于合作豬。 4、合作豬和商品化白豬SLAⅠ類分子的基因組均由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，基因組結(jié)構(gòu)相似，其中Ⅰ類分子中內(nèi)含子3片段最長；而SLAⅡ類分子β、β鏈的外顯子和內(nèi)含子組成有差異，其中DRA和DQA由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，DQB由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，DRB則由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。在SLAⅡ類分子中，DR

8、A、DRB和DQA的內(nèi)含子1均長于其他內(nèi)含子，而DQB較為特別，其內(nèi)含子2較長。 5、合作豬SLAⅠ類分子基因組外顯子2和3共有14個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中SLA-2有7個(gè)新的SNPs位點(diǎn)主要位于α2功能區(qū)，SLA-3有7個(gè)新的SNPs位點(diǎn)主要位于α2和α3功能區(qū)。而SLAⅡ類分子基因組外顯子2共有3個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中DQB有2個(gè)新的SNPs位點(diǎn)主要位于β1區(qū)，而DRB僅有1個(gè)新的SNPs位點(diǎn)主要位于β1區(qū)。而Ⅰ類分子基因

9、組的內(nèi)含子2和3的多態(tài)性比較，發(fā)現(xiàn)存在單個(gè)核苷酸的變異和短片段的缺失。DRA和DQA的內(nèi)含子1的多態(tài)性主要表現(xiàn)也為單個(gè)核苷酸的變異和短片段的缺失，但DRB基因內(nèi)含子1的多態(tài)性主要表現(xiàn)為200多個(gè)bp長片段序列的插入和缺失，在DQB的內(nèi)含子2同樣具有連續(xù)的10多個(gè)核苷酸的插入和缺失現(xiàn)象，且其多次出現(xiàn)。因此，合作豬SLAⅠ類和Ⅱ類分子的內(nèi)含子組成具有高度的多態(tài)性，并遠(yuǎn)高于其外顯子。 6、首次完整地克隆和分析了合作豬和商品化白豬SLA

10、Ⅰ類（SLA-1、-2和-3）和Ⅱ類分子基因（DRA、DRB、DQA和DQB）的上游啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)，并與HLAⅠ類和Ⅱ類分子基因的上游調(diào)控區(qū)比較，證實(shí)其結(jié)構(gòu)類型和排列順序基本一致。發(fā)現(xiàn)SLAⅠ類（SLA-1、-2和-3）基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的調(diào)控元件含有SP1、增強(qiáng)子A、干擾素調(diào)控因子（ISRE）、W/S盒、X盒、Y盒、CAAT盒和TATA盒，其中CAAT盒高度保守，而其他調(diào)控元件均具有多態(tài)性：而SLAⅡ類分子基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件在基因間則

11、不一致，其中SLA-DRA上游調(diào)控區(qū)含有部分的Y盒、八聚體復(fù)合物和T區(qū)等調(diào)控因子，均高度保守，但沒有發(fā)現(xiàn)CCAAT和TATA等區(qū)；SLA-DQA上游調(diào)控區(qū)含有W盒、核因子κ（NF-κB）/增強(qiáng)子A、S盒、X盒、Y盒和T盒，僅W盒具有多態(tài)性；而SLA-DQB和-DRB基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的調(diào)控元件一致，均含有W/S盒、X盒、Y盒、CCAAT和TATA盒，其中僅CCAAT盒高度保守，其他均具有多態(tài)性。此外，在各調(diào)控元件之間分布著多態(tài)性位點(diǎn)。

12、 7、SLAⅠ類分子基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，與參考序列比較共有23個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中合作豬與商品化白豬SLA-2-URR間有14個(gè)，主要位于各調(diào)控元件之間；合作豬SLA-3-URR有9個(gè)新的SNPs位點(diǎn)和1個(gè)缺失位點(diǎn)，主要位于各調(diào)控元件之間和增強(qiáng)子A及SP1盒中。在SLAⅠ類分子基因啟動(dòng)子區(qū)的23個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，合作豬有19個(gè)，而商品化白豬僅有4個(gè)。SLAⅡ類分子基因啟動(dòng)子區(qū)共有13個(gè)新的SNPs位點(diǎn)，其中DQA-URR有

13、5個(gè)，主要位于W盒和W盒；DRB-URR共有8個(gè)，主要位于各調(diào)控元件之間。說明合作豬SLAⅠ類、Ⅱ類分子基因啟動(dòng)子區(qū)具有多態(tài)性，且在SLAⅠ類分子高于商品化白豬。 8、選擇合作豬SLAⅡ類分子的DQA外顯子2進(jìn)行遺傳演化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)AT含量大于GC含量，核苷酸的非同義置換率高于同義置換率，且ka/Ks<1，說明DQA基因外顯子2序列經(jīng)受著平衡選擇且偏向于陰性選擇的影響；用Tajima'sD值進(jìn)行中性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tajima'sD

14、值為0，54649>0．1（P>0．10）符合中性突變，說明平衡選擇對(duì)DQA的進(jìn)化具有重要的意義，基因序列進(jìn)化方式為平衡選擇，而且有一些單倍型的分化。每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸置換率Pi（π）和Theta-W的值分別為0．04016和0．03694，且平均堿基配對(duì)遺傳距離為0．0418±0．0081。 總之，對(duì)合作豬白細(xì)胞抗原的Ⅰ類和Ⅱ類分子基因的分析表明：SLAⅠ類和Ⅱ類分子基因具有豐富的多態(tài)性，且具有單倍型的分化，說明合作豬具有獨(dú)特的