仿刺參(Apostichopus japonicus，Selenka)體腔液中調(diào)理素樣分子的研究.pdf

1、仿刺參是我國(guó)遼寧、山東、河北等北方沿海省份重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。仿刺參體腔液中的吞噬細(xì)胞在吞噬過(guò)程中起重要作用，而吞噬作用在無(wú)脊椎動(dòng)物免疫防御中居于核心地位。調(diào)理素是一些血漿蛋白質(zhì)，它們可以結(jié)合到病原體表面，使其成為靶細(xì)胞，為吞噬作用提供標(biāo)記，從而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬作用。目前已在少數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了調(diào)理素樣分子。為了探究仿刺參體腔液中是否存在調(diào)理素樣分子，且分析其調(diào)理素樣分子的的性質(zhì)，采用熱致死酵母細(xì)胞作為吞噬實(shí)驗(yàn)靶細(xì)胞。通過(guò)S

2、DS-PAGE，凝膠過(guò)濾層析，質(zhì)譜分析，氨基酸序列分析等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化和分析；吞噬細(xì)胞對(duì)酵母細(xì)胞的吞噬作用研究采用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果表明，仿刺參的吞噬細(xì)胞在等滲緩沖液、無(wú)細(xì)胞體腔液和酵母細(xì)胞作用的無(wú)細(xì)胞體腔液中均具有吞噬能力。在不同的反應(yīng)基質(zhì)條件下，吞噬細(xì)胞對(duì)酵母細(xì)胞的吞噬率有所不同。當(dāng)反應(yīng)基質(zhì)為無(wú)細(xì)胞體腔液時(shí)，吞噬細(xì)胞對(duì)酵母細(xì)胞的吞噬率最高。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，一種分子量約為18 kDa的分子可以結(jié)合到熱致死酵母細(xì)胞

3、上，增強(qiáng)吞噬作用。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析純化出這種調(diào)理素樣分子。調(diào)理素樣分子功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，這種約18 kDa的調(diào)理素樣分子可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，但其并不能單獨(dú)提高吞噬作用，還需要和體腔液中某種物質(zhì)共同作用才可使吞噬作用得以增強(qiáng)。調(diào)理素樣分子N端前15個(gè)氨基酸序列及質(zhì)譜分析結(jié)果表明，此調(diào)理素樣分子是無(wú)脊椎動(dòng)物調(diào)理素樣分子中的新成員。 Western blots與ELISA分析結(jié)果均表明，脂多糖(LPS)免疫刺激和受傷均可使體腔

4、內(nèi)調(diào)理素樣分子水平增加。注射LPS的仿刺參體腔液中調(diào)理素樣分子含量在注射后1h顯著增加(P＜0.05)。注射后1h到2d內(nèi)顯著高于注射前15 min水平(P＜0.05)。最大量出現(xiàn)在注射后3d到6d，且顯著高于注射后1h到2d水平(P＜0.05)。6d后，調(diào)理素樣分子水平開始下降，并恢復(fù)到在注射后1h到2d水平(P＞0.05)。注無(wú)菌海水(SSW)的海參體內(nèi)調(diào)理素樣分子水平較低。注射前15min到注射后12 h體腔液中調(diào)理素樣分子含量均

5、無(wú)顯著變化(P＞0.05)。注射后第2 d到8 d，調(diào)理素樣分子含量升高并顯著高于注射前15 min到注射后12 h水平(P＜0.05)。這是因?yàn)椴扇∽⑸涞姆绞?，仿刺參?huì)受傷，而受傷所產(chǎn)生的應(yīng)激也可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 注射LPS的仿刺參體腔液中調(diào)理素樣分子水平除注射前15 min，注射后第2 d和8 d無(wú)顯著差異外(P＞0.05)，其它時(shí)間均顯著高于注射SSW組(P＜0.05)。這表明了LPS免疫刺激及受傷刺激均可使仿刺參體

6、內(nèi)調(diào)理素樣分子含量增加。而受傷和LPS共同刺激可使機(jī)體分泌更多的調(diào)理素樣分子。 該調(diào)理素樣分子具凝集素性質(zhì)，推測(cè)它是一種凝集素。該調(diào)理素樣分子可以凝集兔、雞、鼠、鯽和人的A、B、O、AB型紅細(xì)胞。其凝集結(jié)果為：雞＞兔＞人(A=B=O=AB)＞鼠＞鯽。凝菌結(jié)果表明，純化的調(diào)理素樣分子可凝集革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。細(xì)菌中以鰻弧菌對(duì)調(diào)理素樣分子最敏感。在25-60℃保溫30 min，凝集活性均未見改變。在70℃30 min熱處

7、理后仍然對(duì)雞紅細(xì)胞顯示出凝集活性，活性開始下降。在80℃熱處理30 min后失去凝集活力。當(dāng)5.0≤pH≤9.0時(shí)，仿刺參調(diào)理素樣分子具有活性，當(dāng)pH為6.0-8.0時(shí)，活性最高，當(dāng)pH為5.0或9.0時(shí)，活性下降，當(dāng)pH≥10.0或≤4.0時(shí)，失去凝集活力。調(diào)理素樣分子不被所測(cè)試的D-葡萄糖(D-Glueose)、D-半乳糖(D-Galaetose)、L-Arabinose(L-巖藻糖)、D-木糖(D-Xylose)、D-甘露糖(D-

8、Mannose)、L-鼠李糖(L-Rhamnose)、D-果糖(D-Frutose)和LPS所抑制。可被N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)、牛下顎粘液素(Bovine submaxillary mucin，BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脫唾液酸牛下顎粘液素(Asialo-BSM)、脫唾液酸胎球蛋白(Asialo-Fetuin)所抑制。N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、

9、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的最小抑制濃度分別為20.15 mmol/L、12.50 mmol/L和0.25mmol/L。牛下顎粘液素(Bovine submaxillary mucin，BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脫唾液酸牛下顎粘液素(Asialo-BSM)、脫唾液酸胎球蛋白(Asialo-Fetuin)的最小抑制濃度分別為0.39 mg/mL、1.56 mg/mL、3.12 mg/mL和6