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文檔簡(jiǎn)介
1、家犬是人類最親密的伙伴和朋友,也是人類第一個(gè)馴化的家養(yǎng)動(dòng)物,有關(guān)家犬的起源、進(jìn)化和品種形成等問(wèn)題一直是各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一,關(guān)于家犬的起源問(wèn)題,目前已基本達(dá)成共識(shí),即世界范圍內(nèi)的所有家犬都起源于灰狼。但是,關(guān)于家犬的起源地和具體起源時(shí)間研究結(jié)果并不一致,仍然存在較大的分歧。那么對(duì)目前世界上現(xiàn)存的古老犬種進(jìn)行分析將是揭示家犬發(fā)源地和起源時(shí)間的有效方法。藏獒是目前世界上最古老、最兇猛的大型家犬品種之一,因此藏獒起源以及與其它家犬品種系統(tǒng)發(fā)
2、育關(guān)系的研究對(duì)于揭示家犬的起源、起源時(shí)間和起源地點(diǎn)都具有重要意義。但是目前藏獒的研究工作比較滯后,關(guān)于藏獒的起源、分類地位,以及與其它大型家犬品種間關(guān)系的研究報(bào)道較少。為了揭示藏獒的起源以及與其它家犬品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,我們測(cè)定了藏獒線粒體基因組全序列,分析了藏獒線粒體基因組的基因組成、特征,以及與犬屬物種(家犬、灰狼和郊狼等)和哺乳動(dòng)物的差異;利用線粒體基因組12個(gè)編碼蛋白基因、COI基因、DNA條形碼、控制區(qū)和高變區(qū)Ⅰ序列分析了藏
3、獒的起源、分類地位以及與其它家犬品種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,推測(cè)藏獒和家犬的起源時(shí)間;測(cè)定了藏獒群體控制區(qū)序列,利用控制區(qū)和538bp高變區(qū)Ⅰ序列分析了藏獒群體的遺傳多樣性。具體結(jié)果如下:
(1)藏獒線粒體基因組全序列測(cè)定與分析
通過(guò)克隆測(cè)序和序列拼接首次獲得了藏獒線粒體基因組全序列(GenBank序列號(hào)為HM048871),發(fā)現(xiàn)藏獒線粒體基因組全長(zhǎng)16710bp,包括13個(gè)編碼蛋白基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)r
4、RNA基因和1個(gè)非編碼區(qū)(即D-loop區(qū)),基因組成、排列方式和位置均與哺乳動(dòng)物其他物種基本一致。藏獒線粒體基因組序列中T、C、A、G等4種堿基含量分別為28.7%、25.6%、31.6%和14.1%,其中AT含量(60.3%)明顯高于GC含量(39.7%).藏獒線粒體基因組13個(gè)編碼蛋白基因序列長(zhǎng)度為11410bp,其中序列最長(zhǎng)的基因?yàn)镹D5(1821bp),最短的為ATPase8(204bp);共發(fā)現(xiàn)4種起始密碼子,大多數(shù)編碼蛋白
5、基因(8個(gè))均以ATG為起始密碼子,ND2、ND3和ND5基因以ATA為起始密碼子,ND6基因以AAT為起始密碼子,而ND4L基因以GTG為起始密碼子;11個(gè)編碼蛋白基因的終止密碼子為TAA,其中4個(gè)基因?yàn)椴煌耆K止密碼子,而CytB基因和ND2基因的終止密碼子分別為AGA和TAG。藏獒線粒體基因組D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)為1250bp,定位在tRNA-Pro與tRNA-Phe之間,包括2個(gè)保守序列模塊即CSBⅠ和CSBⅡ,而在2個(gè)保守序
6、列模塊之間有一個(gè)短片段重復(fù)區(qū),這個(gè)重復(fù)區(qū)是由一個(gè)包含10個(gè)核苷酸構(gòu)成的重復(fù)單元5'-GTACACG T(G/A)C-3'經(jīng)過(guò)30個(gè)重復(fù)形成的.藏獒線粒體22個(gè)tRNA基因序列長(zhǎng)度在66—75bp之間,總長(zhǎng)度為1521bp,與引物源序列(家犬,GenBank序列號(hào):U96639)tRNA的同源性為為99.08%,共有4個(gè)變異位點(diǎn).藏獒線粒體12s rRNA和16s rRNA基因全長(zhǎng)分別為954bp、1580bp,與與引物源序列的同源性為9
7、9.96%,僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn),即在16s rRNA基因nt372位點(diǎn)發(fā)生了A/G轉(zhuǎn)換。
(2)藏獒的起源及與其它家犬品種的系統(tǒng)發(fā)育分析
采用NJ法、MP法和網(wǎng)絡(luò)法,分別根據(jù)線粒體基因組H鏈12個(gè)編碼蛋白基因、COI基因、DNA條形碼(648bp)、控制區(qū)和控制區(qū)582bp高變區(qū)Ⅰ等5種序列,結(jié)合我們測(cè)定的和GenBank中收錄的家犬、灰狼和郊狼的相應(yīng)序列,以郊狼為外類群,構(gòu)建了藏獒、家犬品種和灰狼的系統(tǒng)發(fā)育
8、樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖均顯示:藏獒、家犬品種與灰狼聚在一起,而外類群郊狼單獨(dú)聚為一類,說(shuō)明藏獒和其它家犬一樣起源于灰狼;且藏獒與家犬品種間線粒體基因組5種序列的序列差異均小于藏獒與灰狼間的,而大于家犬品種間的,認(rèn)為藏獒是家犬亞種中的一個(gè)品種,在動(dòng)物分類地位上應(yīng)該隸屬于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬屬(Canis)、狼種(Canis lupus)、家犬亞種(Canis lupus famil
9、iaris).藏獒、家犬品種聚為4個(gè)分支,說(shuō)明家犬至少有4個(gè)母系起源,與前人的研究結(jié)果基本一致;藏獒和部分的大型家犬品種如圣伯納犬、英國(guó)老式牧羊犬等屬于分支A,且藏獒與圣伯納犬、英國(guó)老式牧羊犬等大型家犬品種間的5種序列的序列差異、遺傳距離均最小,說(shuō)明藏獒與圣伯納犬、英國(guó)老式牧羊犬等大型家犬品種問(wèn)的親緣關(guān)系較近,從分子水平上證實(shí)了圣伯納犬、英國(guó)老式牧羊犬等大型犬在品種形成過(guò)程中可能摻入了藏獒的血統(tǒng)。
利用Savolainen
10、等(2002)的方法,線粒體基因組H鏈12個(gè)編碼蛋白基因、COI基因、控制區(qū)和控制區(qū)582bp高變區(qū)Ⅰ的堿基替換率估計(jì)藏獒、家犬不同分支與灰狼間的分化時(shí)間.結(jié)果發(fā)現(xiàn):綜合考慮4個(gè)分支,家犬與灰狼間的分化時(shí)間分別為16000 YBP、32000 YBP、65000 YBP和50000 YBP,我們估計(jì)的家犬起源時(shí)間界于目前研究的最早的家犬起源時(shí)間(100000 YBP)和最晚的家犬起源時(shí)間(15000 YBP)之間,綜合各種因素,我們認(rèn)為
11、家犬的起源時(shí)間至少在16000YBP,與Savolainen等(2002)、Pang等(2009)估計(jì)的家犬起源時(shí)間(分別為15000YBP、16300 YBP)一致,也符合根據(jù)化石推測(cè)的起源時(shí)間(26000 YBP);藏獒的起源時(shí)間分別為18000 YBP、33000 YBP、68000 YBP和56000 YBP,均早于相應(yīng)序列估計(jì)的家犬起源,且系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)藏獒與一些古老的家犬品種(如英國(guó)老式牧羊犬等)聚為一類,序列差異和遺傳距
12、離均較小,與英國(guó)老式牧羊犬共享DNA條形碼單倍型,說(shuō)明藏獒是目前世界上最古老的家犬品種之一。
(3)藏獒群體遺傳多樣性分析
通過(guò)克隆測(cè)序獲得了40個(gè)藏獒個(gè)體線粒體基因組控制區(qū)全序列,對(duì)藏獒控制區(qū)的結(jié)構(gòu)、控制區(qū)和538bp高變區(qū)Ⅰ序列的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,并與犬屬7個(gè)群體(金毛尋回獵犬、拉布拉多獵犬、伊利里亞牧羊犬、土耳其牧羊犬、中國(guó)灰狼、歐洲灰狼、郊狼)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示:藏獒群體控制區(qū)全序列的長(zhǎng)度從12
13、40bp到1320bp不等,其中主要的長(zhǎng)度類型為1270bp(32.5%,13/40),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)藏獒控制區(qū)全序列的長(zhǎng)度多態(tài)性主要是由重復(fù)單元數(shù)量的不同引起的;在40個(gè)藏獒的控制區(qū)全序列中共檢測(cè)到75個(gè)變異位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)百分率為5.68%,其中單一多態(tài)位點(diǎn)14個(gè),占多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)的18.67%,簡(jiǎn)約信息多態(tài)位點(diǎn)61個(gè),占多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)的81.33%;核苷酸變異類型中只有轉(zhuǎn)換、插入/缺失,沒(méi)有顛換出現(xiàn),表現(xiàn)出高度的轉(zhuǎn)換偏愛(ài)性;藏獒控制區(qū)全
14、序列的單倍型多樣度(H)為0.990,核苷酸多樣度(pi)為1.201,平均核苷酸差異數(shù)目(k)為13.082,均高于拉布拉多犬和金毛尋回獵犬群體,但與哺乳動(dòng)物其他物種相比,核苷酸多樣度偏低。
在犬屬8群體中,野生群體(中國(guó)灰狼、歐洲灰狼和郊狼)線粒體控制區(qū)538bp高變區(qū)Ⅰ序列的單倍型多樣度(H)、核苷酸多樣度和平均核苷酸差異數(shù)目均明顯高于5個(gè)家犬品種;在5個(gè)家犬品種內(nèi),土耳其牧羊犬的多態(tài)位點(diǎn)最多為21個(gè)(3.90%)、
15、其次是藏獒和伊利里亞牧羊犬,發(fā)現(xiàn)了19個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(3.53%);家犬品種289個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到36個(gè)單倍型,其中29個(gè)單倍型為相應(yīng)品種特有,有7個(gè)共享單倍型;藏獒的單倍型多樣性最豐富,單倍型多樣度為0.854,而金毛尋回獵犬的單倍型多樣性最貧乏,單倍型多樣度為0.471;但是,藏獒的核苷酸多樣度和平均核苷酸差異數(shù)目最小,分別為0.845和4.519,伊利里亞牧羊犬的核苷酸多樣度最豐富(1.427)、平均核苷酸差異數(shù)目最大(7.661).藏
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