苜蓿夜蛾和大豆食心蟲(chóng)氣味感受相關(guān)蛋白基因的克隆分析及表達(dá).pdf

1、苜蓿夜蛾(鱗翅目：夜蛾科)和大豆食心蟲(chóng)(鱗翅目：小卷蛾科)是大豆生長(zhǎng)期和結(jié)莢期的兩種主要害蟲(chóng)，隨著近年來(lái)免耕和重迎茬面積增加，兩種害蟲(chóng)的發(fā)生明顯加重，成為造成大豆品質(zhì)和產(chǎn)量降低的主要因素之一。昆蟲(chóng)觸角是嗅覺(jué)感器分布集中的部位，觸角上的各種感器調(diào)節(jié)著昆蟲(chóng)行為與化學(xué)、物理等各種環(huán)境刺激因子的關(guān)系，在昆蟲(chóng)的寄主定位、識(shí)別、取食、覓偶、交配、繁殖、棲息、防御與遷移等過(guò)程中起著極為重要的作用。因此，研究其嗅覺(jué)感器的形態(tài)與結(jié)構(gòu)是探索昆蟲(chóng)嗅覺(jué)行為和識(shí)

2、別機(jī)制的必要前提。昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程是非常復(fù)雜的，多種蛋白參與了這一過(guò)程，這些蛋白主要包括氣味結(jié)合蛋白、氣味受體以及氣味降解酶。深入研究嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程中的幾個(gè)主要蛋白的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于闡明嗅覺(jué)識(shí)別的分子機(jī)理非常重要。因此，本試驗(yàn)以苜蓿夜蛾和大豆食心蟲(chóng)為研究對(duì)象，利用掃描電鏡對(duì)觸角的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到了嗅覺(jué)識(shí)別的相關(guān)基因，并對(duì)相關(guān)基因的功能進(jìn)行了分析，以期為闡明這兩種害蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別的分子機(jī)理提供依據(jù)。<

3、br>　　 利用掃描電鏡對(duì)苜蓿夜蛾觸角上的感受器類型進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，雌雄苜蓿夜蛾的觸角類型都是線狀觸角，由柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)組成。觸角上有8種感器分布，分別為毛形感器、刺形感器、錐形感器、腔錐形感器、耳形感器、鱗形感器、栓錐形感器和Bohm氏鬃毛，觸角感器主要分布于觸角的迎風(fēng)面和側(cè)面，柄節(jié)周圍被鱗片包被，鞭節(jié)背風(fēng)面有半包圍狀整齊排列的鱗片，鱗片結(jié)合處有零星分布的磷形感器、刺形感器；在整個(gè)觸角上，感器主要集中在鞭節(jié)，柄節(jié)和梗節(jié)較少。不

4、同類型感器相比而言，以毛形感器數(shù)量最多，刺形感器排列較為整齊和規(guī)律。每一鞭小節(jié)背風(fēng)面都覆蓋有鱗片，后排鱗片的前緣蓋著前排鱗片的基部，層層相疊，絕大多數(shù)感器著生在觸角的迎風(fēng)面和側(cè)面。
　　 利用RT-PCR和RACE的方法得到了苜蓿夜蛾和大豆食心蟲(chóng)的五個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)和一個(gè)氣味受體蛋白(Or83b)基因的全長(zhǎng)，其中包括兩種昆蟲(chóng)的信息素結(jié)合蛋白(PBP)和普通氣味結(jié)合蛋白1(GOBP1)，苜蓿夜蛾的普通氣味結(jié)合蛋白2(GOB

5、P2)和受體蛋白Or83b蛋白。用苜蓿夜蛾的信息素結(jié)合蛋白、普通氣味結(jié)合蛋白1和2三條序列構(gòu)建了三個(gè)基因的原核表達(dá)載體，并且在大腸桿菌中成功進(jìn)行了表達(dá)。
　　 苜蓿夜蛾P(guān)BP基因cDNA序列的全長(zhǎng)為625個(gè)堿基，包括一個(gè)510個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼170個(gè)氨基酸組成的多肽，推導(dǎo)出的分子量為19.0kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為5.65。在27-28位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)，并存在1個(gè)N位糖基化位點(diǎn)。大豆食心蟲(chóng)PBP基因cDNA序列的全長(zhǎng)為6

6、10個(gè)堿基，包括一個(gè)504個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼168個(gè)氨基酸組成的多肽，推導(dǎo)出的分子量為19.3kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為5.55。在24-25位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)，并在52的位置上有一個(gè)N位糖基化位點(diǎn)。通過(guò)和已知昆蟲(chóng)PBP基因cDNA序列的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩種昆蟲(chóng)的PBP基因氨基酸序列有典型OBP家族特點(diǎn)的六個(gè)保守的半胱氨酸，苜蓿夜蛾和大豆食心蟲(chóng)PBP與其他已知鱗翅目昆蟲(chóng)PBP的同源性分別在44％-96％和45％-70％之間，對(duì)比過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在

7、已研究昆蟲(chóng)PBPs的研究發(fā)現(xiàn)多種昆蟲(chóng)中存在三種PBPs，也就是PBP存在不同的亞型，多種PBP存在的特征可能與昆蟲(chóng)間信息素成分的多樣性有關(guān)。
　　 苜蓿夜蛾GOBP1基因cDNA序列的全長(zhǎng)為973個(gè)堿基，包括一個(gè)495個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼164個(gè)氨基酸組成的多肽，推導(dǎo)出的分子量為19.0kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為5.32。在19-20位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。大豆食心蟲(chóng)GOBP1基因cDNA序列的全長(zhǎng)為920個(gè)堿基，包括一個(gè)492個(gè)堿

8、基的開(kāi)放讀碼框編碼163個(gè)氨基酸組成的多肽，推導(dǎo)出的分子量為18.8kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為5.29。在19-20位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。通過(guò)和已知昆蟲(chóng)GOBP1基因的cDNA序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩種昆蟲(chóng)的GOBP1基因氨基酸序列有典型OBP家族特點(diǎn)的六個(gè)保守的半胱氨酸，苜蓿夜蛾和大豆食心蟲(chóng)GOBP1與其他已知鱗翅目昆蟲(chóng)GOBP1的同源性分別在63％-95％和65％-82％之間。
　　 苜蓿夜蛾GOBP2基因cDNA序列全長(zhǎng)為624個(gè)堿基，

9、包括一個(gè)489個(gè)堿基的開(kāi)放讀碼框，編碼162個(gè)氨基酸組成的多肽，推導(dǎo)出的分子量為18.2kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為.5.30。在21-22位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。通過(guò)和已知昆蟲(chóng)GOBP2基因的cDNA序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)有典型OBP家族特點(diǎn)的六個(gè)保守的半胱氨酸，與已知鱗翅目昆蟲(chóng)GOBP2的同源性在750％-99％，說(shuō)明GOBP2基因在鱗翅目昆蟲(chóng)中比較保守。
　　 苜蓿夜蛾Or83b基因cDNA序列全長(zhǎng)1715個(gè)堿基，包括一個(gè)1422個(gè)堿基的開(kāi)

10、放讀碼框，編碼473個(gè)氨基酸，分子量約為53.5kD，多肽的預(yù)測(cè)等電點(diǎn)pI為8.37。對(duì)苜蓿夜蛾Or83b氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)苜蓿夜蛾Or83b氨基酸序列中存在2個(gè)N位糖基化位點(diǎn)，N-端無(wú)信號(hào)肽，含有7個(gè)跨膜區(qū)域，N末端在細(xì)胞膜內(nèi)，而C末端在細(xì)胞膜外，符合昆蟲(chóng)氣味受體的結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)和已知昆蟲(chóng)的Or83b基因的cDNA序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)苜蓿夜蛾的Or83b和其他鱗翅目昆蟲(chóng)Or83b同源性達(dá)到96％以上。
　　 對(duì)五條氣味結(jié)合

11、蛋白的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這五條基因編碼的蛋白具有昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白的典型特征：小分子量、水溶性酸性蛋白；序列中有6個(gè)保守的半胱氨酸，N-末端有信號(hào)肽，具有分泌蛋白的特征。苜蓿夜蛾氣味受體蛋白Or83b具有昆蟲(chóng)氣味受體的典型特征：具有七個(gè)跨膜區(qū)，N末端在細(xì)胞膜內(nèi)，C末端在細(xì)胞膜外，N-無(wú)信號(hào)肽。
　　 對(duì)苜蓿夜蛾P(guān)BP、GOBP1、GOBP2和Or83b四條基因在雌雄成蟲(chóng)的觸角、腹部和足三個(gè)器官的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明四條基