植物氣味分子與苜蓿盲蝽化學(xué)感受蛋白識別結(jié)合特性研究.pdf

1、昆蟲通過靈敏的嗅覺系統(tǒng)來識別環(huán)境中復(fù)雜的化學(xué)信號,如配偶釋放的性信息素或植物的揮發(fā)性氣味化合物,從而引起昆蟲的擇偶,交配,定位寄主植物,尋找產(chǎn)卵場所等行為。在昆蟲的嗅覺識別過程中,不同種類的植物氣味化合物在不同的載體蛋白的幫助下穿過化學(xué)感受器中的極性淋巴液,到達分布于觸角嗅覺感器的特化上皮中的特殊神經(jīng)元或一般化學(xué)感受系統(tǒng)的特殊神經(jīng)元,并與其上的氣味受體作用,引起嗅覺神經(jīng)沖動,進而引起昆蟲的各種行為反應(yīng)。許多研究表明小分子可溶性化學(xué)感受蛋

2、白在傳遞疏水性氣味化合物到達氣味受體的過程中作為載體蛋白起到了重要的作用。利用昆蟲的嗅覺識別機制,以CSPs作為潛在的靶標(biāo)基因,干擾昆蟲的寄主定位及交配等行為,用于害蟲綜合治理已成為當(dāng)今研究的熱點問題。具有理論和實際的意義。
　　 苜蓿盲蝽作為我國的主要害蟲之一,對我國的棉花等重要作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,因此本實驗以苜蓿盲蝽的化學(xué)感受蛋白為目標(biāo),采用qPCR法研究了其在苜蓿盲蝽不同發(fā)育階段及不同組織中的表達情況,利用原核

3、表達系統(tǒng)進行化學(xué)感受蛋白AlinCSPs的表達,純化出可溶的重組化學(xué)感受蛋白,以同源建模的方法得到了苜蓿盲蝽化學(xué)感受蛋白的三維結(jié)構(gòu)并對可能的結(jié)合位點進行了預(yù)測,并通過定點突變的方法及熒光競爭結(jié)合實驗來驗證。進行熒光競爭結(jié)合實驗,篩選出結(jié)合能力強的植物氣味化合物,以這些植物氣昧化合物為處理,選擇空氣為對照,用Y型管對苜蓿盲蝽成蟲進行了嗅覺行為測試,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.本實驗利用原核表達系統(tǒng),克隆、表達、純化了3個新的苜蓿

4、盲蝽化學(xué)感受蛋白(AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP6)。選擇β-actin基因為內(nèi)參基因,以苜蓿盲蝽化學(xué)感受蛋白AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP6,AlinCSP7,AlinCSP8基因為目的基因,運用qPCR的方法研究了目的基因在苜蓿盲蝽不同發(fā)育階段(1齡,2齡,3齡,4齡,5齡,6齡)和不同組織(觸角,頭,胸,腹,足,翅)中的相對表達量。在苜蓿盲蝽目的基因與內(nèi)參基因擴增效率一致的情況下,利用公式2

5、-ΔΔCT直接算出AlinCSPs的表達量。實驗結(jié)果表明AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP8,以及AlinCSP7主要在苜蓿盲蝽的2齡若蟲中表達,據(jù)此我們可以推測AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP8和AlinCSP7在苜蓿盲蝽的早起發(fā)育中起重要的作用。而AlinCSP6則主要在苜蓿盲蝽成蟲中表達。AlinCSP4和AlinCSP6主要在苜蓿盲蝽的足中表達,AlinCSP5和AlinCSP8則主要在苜蓿盲蝽

6、的觸角中表達。而AlinCSP7主要在苜蓿盲蝽的翅中表達,這表明AlinCSP7在苜蓿盲蝽的翅形成過程中可能起重要的作用。
　　 2.采用3D-Jury方法(Ginalski等,2003)對CSP4,CSP5,CSP6的氨基酸序列進行分析,獲得模板。使用Discovery Studio2.0軟件(Accelrys Software Inc.)構(gòu)建三維模型。使用profiles-3D方法(Luthy等,1992)以及拉氏圖(Ram

7、achandran等,1963)對模型的有效性進行驗證。模型確定后,使用DiscoveryStudio2.0對模型搜索配體結(jié)合區(qū)域.結(jié)果表明AlinCSP4結(jié)構(gòu)包括6個α-螺旋結(jié)構(gòu),分別為17-22(α1),24-34(α2),40-56(α3),64-80(α4),84-92(α5)and97-105(α6),及兩個二硫橋鍵Cys33-Cys40和Cys59-Cys62,此外,推測Ile78,Trp85,Ile51和Phe52在氣味化

8、合物的結(jié)合中起重要作用。AlinCSP5的三維結(jié)構(gòu)表明,AlinCSP5具有一個大的疏水性口袋結(jié)構(gòu),并推測Ile67為其中的一個可能的結(jié)合位點。AlinCSP6的3D結(jié)構(gòu)顯示該蛋白主要由6個α螺旋構(gòu)成,分別是13-18(α1),20-32(α2),39-52(α3),59-76(α4),78-88(α5)和94-102(α6)。Cys29-Cys36和Cys55-Cys58兩個二硫鍵起著穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用。推測AlinCSP6的Ile7

9、4和Phe81基團能夠參與結(jié)合油酸酰胺或其類似物;推測AlinCSP6具有較廣泛的氣味結(jié)合譜,在苜蓿盲蝽嗅覺過程中具有重要作用。
　　 3.在熒光競爭結(jié)合實驗中,選擇了114種植物氣味分子與AlinCSP4的結(jié)合特性,實驗結(jié)果表明,AlinCSP4具有廣泛的結(jié)合譜,除了烯類化合物以外,能夠與醇類,醛類,酮類,酯類,芳香族類等氣味化合物結(jié)合,其中(±)2-undecanol,2-butyl-1-octanol,2-nonancne

10、,2-pentadecanone,nonylacetat,ethyl2-methylbutyrate,methyljasmonate,limonene,2-trpinene,myrcene,1,8-cineole,ethylethe;3,4-dimethylbenzaldehyde,4-ethylbenzaldehyde和benzaldehyde與AlinCSP4的結(jié)合能力最強,兩種信息素butylbutanoate和1-hexylbu

11、tyrate也與AlinCSP4具有明顯的結(jié)合能力。選擇了50種植物揮發(fā)性氣味化合物研究了AlinCSP5的結(jié)合特性,熒光競爭結(jié)合實驗表明AlinCSP5的結(jié)合具有特異性,它能特異的結(jié)合β-citronellol,3-Hexanone,2-Octanone,acetophenone,2,3-dimethyl-benzoicacid,3,4-Dinethylbenzaldehyde,Isoborneol,β-lonone,其中acetop

12、henone與AlinCSP5表現(xiàn)出的結(jié)合能力最強,IC50值為16.305μmol/L。選擇了113種植物氣味分子對AlinCSP6的熒光競爭性結(jié)合實驗。結(jié)果表明,AlinCSP6具有較廣譜的結(jié)合力,能夠與醇,醛,酮,酯,萜,芳香族等多種化合物結(jié)合并表現(xiàn)較強的結(jié)合能力。其中,β-香茅醇β-citronellol,反式-2-己烯醛Trans-2-hexenealdehyde,6-甲基-5-庚烯-2-酮6-methyl-5-Heptene

13、-2-ketone,2-十一烷酮2-Undecanone,乙酰丙酸丁酯Butyllevulinate,月桂烯myrcene,左旋-β-蒎烯(1s)-(-)-β-Pinene,壬烷nonane,3,4-二甲基苯甲醛3,4-dimethylbenzaldehyde,乙醚Ethylether,羅勒烯Ocimene,苯乙酮Acetophenone,苯甲醛benzaldehyde與AlinCSP6有很強的結(jié)合力。
　　 4.利用定點突變的

14、方法將AlinCSP5第67位的異亮氨酸殘基Ile突變成丙氨酸Alanine殘基,突變成AlinCSP5I67A突變體,并對突變體進行表達純化,進行熒光競爭結(jié)合實驗,結(jié)果表明,Ile67突變體不能與β-Citronellol和2,3-Dimethylbenzoicacid相結(jié)合。3-hexanone和acetophenone的結(jié)合能力變化不大,2-octanone,3,4-Dimethylbenzaldehyde,β-lonone和Is

15、oborneol的結(jié)合能力顯著上升。我們推測位于疏水性口袋結(jié)構(gòu)處的疏水性氨基酸參與了氣味化合物的最初識別,并與化學(xué)感受蛋白的特異性結(jié)合有關(guān)。
　　 5.在Y型管嗅覺儀實驗中醇類化合物異樟醇(+-)-Isoborncol,3-己醇3-hexanol,二丁基辛醇2-butyl-1-octanol,醛類化合物正庚醛Heptanal,酮類化合物2-庚酮2-Heptanone,β-紫羅蘭酮β-lonone,2-辛酮2-octanone,2

16、-己酮2-hexanone,6-甲基-5-庚烯-2-酮6-methyl-5-Heptene-2-Ketone,萜類化合物R-(+)-檸檬烯R-(+)-limonene,α-松油烯α-terpinene,香芹醇carveol,α-水芹烯α-phellandrene,烴類化合物戊烷pentane,十一烷undecane,雜環(huán)類化合物β-蒎烯β-Pinene,芳香族類化合物對乙基苯甲醛4-Ethylbenzaldehyde,醚類化合物吲哚In