栽培大豆和灘涂野大豆及其雜交后代苗期耐鹽性與NHX1基因功能的初步研究.pdf

1、本研究以栽培大豆N23674品種（耐鹽性較弱）和灘涂野生大豆BB52種群（耐鹽性較強(qiáng)）及其經(jīng)逐代耐鹽性篩選的雜交后代4076株系（F5代）幼苗為材料，用150mmol·L-1 NaCl溶液脅迫不同時(shí)間后，測定和分析葉和根中Na+、K+和Cl-含量變化。提取葉中DNA，通過抗鹽標(biāo)記基因PCR方法比較和分析了供試3大豆材料的耐鹽性強(qiáng)弱。使用半定量RT-PCR方法分析了大豆葉和根中Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因NHX1mRNA水平的鹽脅迫響應(yīng)差

2、異。分別構(gòu)建表達(dá)載體使NHX1基因在洋蔥表皮細(xì)胞及大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，研究NHX1基因的表達(dá)位點(diǎn)及相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。主要結(jié)果如下：
　　 在150 mmol·L-1NaCl溶液處理大豆幼苗0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、2 d和4 d后，供試大豆葉和根中Na+和Cl+含量均隨鹽脅迫時(shí)間延長而上升，K+含量隨鹽脅迫時(shí)間延長下降，與N23674相比，鹽脅迫下灘涂野大豆BB52種群和及它們的雜交后代4076（F5代

3、）株系（尤其是前者）植株K+含量降幅和Na+增幅均較小，但吸收的Cl-在根中積累較多，而向葉片運(yùn)輸較少。采用抗性標(biāo)記基因PCR的結(jié)果表明：BB52和4076中均擴(kuò)增出兩條條帶，一條為約740bp的耐鹽基因分子標(biāo)記帶，一條為約620bp的鹽敏感基因分子標(biāo)記帶，N23674沖僅擴(kuò)增出一條約620bp的鹽敏感基因分子標(biāo)記帶。
　　 根據(jù)GenBank中GmNHX1（序列登錄號(hào)為AY972078）基因的cDNA序列，在供試3材料中擴(kuò)增出

4、NHX1全長序列，發(fā)現(xiàn)除BB52種群第150個(gè)堿基為T，N23674品種和4076株系及發(fā)表序列此處堿基均為C外，其余堿基間無差異，但該處堿基差異并未造成氨基酸序列的差異。半定量RT-PCR結(jié)果表明，在非鹽處理下栽培大豆N23674中.NHX1基因mRNA豐度高于BB52和4076。150 mmol·L-1 NaCl脅迫12 h過程中，3大豆葉和根中NHX1基因mRNA豐度均表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，其中N23674葉和根中NHX1基因響應(yīng)較BB

5、52迅速，但表達(dá)豐度增加量低于BB52，4076則介于兩者之間。
　　 將NHX1基因插入瞬時(shí)表達(dá)載體-pBI121-GFP中，利用基因槍轉(zhuǎn)化法將pBI121-GFP-NHX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，在其中央大液泡周圍能觀察到強(qiáng)烈熒光信號(hào)，可以判斷該基因編碼蛋白定位于液泡膜上。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30-NHX1，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的SDS-PAGE電泳表明NHX1基因可在BL21中高效表達(dá)。