大豆苗期耐低磷性狀評(píng)價(jià)和低磷脅迫的分子機(jī)理初步研究.pdf

1、磷是植物生長(zhǎng)和新陳代謝所需一種最重要大量元素之一，同時(shí)也是核酸、磷脂、ATP、酶、輔酶的一種關(guān)鍵性成分。磷（植物主要吸收磷酸鹽形式的磷）缺乏是限制植物生長(zhǎng)的第二位的大量元素，其在土壤中以復(fù)雜的、難溶的、無(wú)機(jī)和有機(jī)形式存在，不能被植物直接吸收。植物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量依賴于可利用性Pi（InorganicPhosphate，磷酸鹽），然而在很多自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)有效和可溶性磷極度缺乏的情況。為了適應(yīng)磷缺乏，植物已進(jìn)化獲得精巧的

2、調(diào)控機(jī)制來保持體內(nèi)磷的動(dòng)態(tài)平衡，包括側(cè)根和根毛的發(fā)育、根系構(gòu)型改變（例如蛋白樣和胡蘿卜狀根的形成）、從根系分泌磷酸酶和有機(jī)酸、高低親和性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（phosphatetransporter,PT）的誘導(dǎo)。同時(shí)很多植物與茵根真菌形成共生關(guān)系以便獲得更多的Pi。在植物中存在著很多的適應(yīng)性機(jī)制以減輕或應(yīng)對(duì)磷缺乏。這些機(jī)制的實(shí)現(xiàn)是通過幾百個(gè)基因表達(dá)譜的變化來實(shí)現(xiàn)的。這些感知Pi狀態(tài)和調(diào)整適應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)基因組成網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)在逐漸清晰。目前已鑒定的該網(wǎng)

3、絡(luò)組成包括轉(zhuǎn)錄因子、SPX(Syg1，Pho81，XPR1)亞家族蛋白、非編碼RNA和蛋白修飾物（包括參與SUMO化、磷酸化、去磷酸化以及蛋白運(yùn)輸?shù)母鞣N蛋白）。
　　本研究克隆了PT、PHR（(ph)hosphatestarvationresponse）、SPX和Gm4等相關(guān)基因;并利用生物信息學(xué)方法研究了GmPT1和GmPT2蛋白結(jié)構(gòu);采用綠色熒光蛋白融合PT來研究GmPT1和GmPT2的亞細(xì)胞定位;在酵母突變體中研究GmPT1

4、和GmPT2功能和生化特征;采用Real-timeRT-PCR研究GmPT1和GmPT2表達(dá)模式;利用酵母單雜交的方法研究GmPHR1和GmSPX1的互作;同時(shí)，利用主成分分析和隸屬函數(shù)對(duì)20種大豆基因型進(jìn)行了耐低磷性狀的評(píng)價(jià)。通過研究獲得以下研究結(jié)果:
　　1.根據(jù)主成分和隸屬函數(shù)分析，評(píng)價(jià)供試大豆基因型耐低磷性狀強(qiáng)弱順序。供試基因型耐低磷由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?趕泰、五河齊黃豆、7650、湘豆4號(hào)、先進(jìn)2號(hào)、蘇88M-21、Peki

5、ng、高作選1號(hào)、科豐一號(hào)、新沂小黑豆、南農(nóng)1138-2、94-156、87-23、菏84-5、波高、RN-9、通山薄皮甲、皖82-178、湘秋豆2號(hào)、墊江早黃豆。
　　2.克隆得到兩個(gè)PT基因分別在大豆染色體Gm10(41，391，168～41，393，008)和Gm20(42，980，124～42，981，928)上，分別命名為GmPT1(登錄號(hào):HQ392508)、GmPT2（登錄號(hào):HQ392509）。GmPT1含有184

6、1個(gè)堿基其開放閱讀框編碼536個(gè)氨基酸（分子量為58730.46Da）。GmPT2含有1802個(gè)堿基其開放閱讀框編碼536個(gè)氨基酸（分子量為58627.29Da）。GmPT1和GmPT2的開放閱讀框都是從第23～1633bp，在核苷酸序列上有88.7％一致性，在氨基酸序列上有97.9％的一致性。GmPT1和GmPT2氨基酸序列與擬南芥、番茄、馬鈴薯和蒺藜苜蓿有著很高相似性。GmPT1和GmPT2與來自真菌的PT——茵根真菌(GvPT)以

7、及釀酒酵母(PHO84)有著很高的一致性。GmPT1氨基酸序列與GvPT（登錄號(hào):Q00908）、PHO84（登錄號(hào):P25297）分別有76％、61％一致性;GmPT2氨基酸序列與GvPT（登錄號(hào):Q00908）、PHO84（登錄號(hào):P25297）分別有76％、63％一致性。GmPT1和GmPT2的疏水性分析表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體均有12個(gè)跨膜區(qū)域（TM，transmembrane），這是PT的共同特征，與PT的親和性無(wú)關(guān)。GmPT1和Gm

8、PT2的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明這兩個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有12個(gè)跨膜區(qū)域，在TM6和TM7間存在一個(gè)大親水環(huán)。
　　3.利用Tbpred預(yù)測(cè)服務(wù)器來預(yù)測(cè)GmPT1和GmPT2亞細(xì)胞定位，其預(yù)測(cè)結(jié)果為GmPT1和GmPT2是整合性膜蛋白。為了驗(yàn)證GmPT1和GmPT2亞細(xì)胞定位，將綠色熒光蛋白(GFP)融合到GmPT1或GrPT2的ORF的3，端。在以GmPT1/GFP或GmPT2/GFP進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以觀察到細(xì)胞周圍有著清晰的熒光信

9、號(hào)，轉(zhuǎn)化空載的細(xì)胞則可以觀察到整個(gè)細(xì)胞充滿熒光信號(hào)。GmPT1/GFP和GmPT2/GFP融合蛋白定位在細(xì)胞的周邊，表明這兩個(gè)蛋白定位在細(xì)胞膜。這個(gè)結(jié)果與早期生化研究一致，這些數(shù)據(jù)表明GmPT1和GmPT2定位在細(xì)胞膜。
　　4.利用抑制劑來驗(yàn)證Pi運(yùn)輸?shù)膒H依賴性。Pi運(yùn)輸活性在pH值4～7范圍內(nèi)進(jìn)行研究，其活性在不同的pH值下表現(xiàn)出差異——當(dāng)pH值為4時(shí)其活性達(dá)到最高并隨著pH值升高其活性下降。為了研究質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力對(duì)Pi運(yùn)輸活性

10、的影響，本實(shí)驗(yàn)使用解偶聯(lián)劑——2，4-二硝基苯酚(DNP)和羰基羥基氰氯苯腙(CCCP)，這些解偶聯(lián)劑可以破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度。DNP在濃度為100μM時(shí)Pi吸收率相比較無(wú)抑制劑的對(duì)照減至79％(GmPT1)和82％(GmPT2)。CCCP在濃度為100tM時(shí)Pi吸收率相比較無(wú)抑制劑的對(duì)照減至77％（GmPT1）和80％(GmPT2)。釩酸鹽——一種P-類型H+-ATPase抑制劑——在濃度為100μM時(shí)Pi吸收率相比較無(wú)抑制劑的對(duì)

11、照減至82％(GmPT1)和83％(GmPT2)。這些結(jié)果表明其吸收率相比較對(duì)照明顯地降低了。這些結(jié)果證實(shí)了GmPT1和GmPT2的Pi/H+共轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于細(xì)胞膜內(nèi)外的pH梯度，其pH梯度的維持正是質(zhì)膜上的H+-ATPase的作用。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明不同的陽(yáng)離子不會(huì)降低Pi吸收速率，表明GmPT1和GmPT2對(duì)Pi吸收的高度特異性。含有GmPT1和GmPT2的菌株在毫摩爾濃度(mM)的Pi濃度下其吸收率與含空載的菌株相似。在32pi吸收實(shí)驗(yàn)中，

12、其吸收過程中的前5min吸收速率是線性的，利用Lineweaver-Burk圖可以計(jì)算GmPT1和GmPT2的Km，得到GmPT1和GmPT2的Km分別為6.65mM和6.63mM。因此，GmPT1和GmPT2是低親和PT并且依賴于質(zhì)膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度。
　　5.播種7d后的大豆幼苗的根系、莖和葉片組織用于研究GmPT1和GmPT2的表達(dá)。在低磷脅迫的48h之內(nèi)，幼苗的根系、莖和葉片中GmPT1和GmPT2的表達(dá)量都是升高的。48h

13、高磷處理后，將幼苗進(jìn)行低磷脅迫，3h后其幼苗的根系、莖和葉片中GmPT1和GmPT2的表達(dá)量也是上調(diào)的。用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌的幼苗移栽到高磷溶液后，其幼苗的GmPT1和GmPT2的表達(dá)量只有輕微的改變。48h低磷處理的幼苗移栽到高磷溶液3h后，其根系、莖和葉片中的GmPT1和GmPT2的表達(dá)量降低。然而，GmPT1和GmPT2基因的表達(dá)水平并沒有受到磷濃度影響而顯著地改變（其相對(duì)倍數(shù)變化是很小的）并且這種變化趨勢(shì)是復(fù)雜的，這表明