利用熒光定量PCR技術(shù)分析捕食性天敵對大豆蚜的控害作用.pdf

1、大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）是近年來發(fā)生較為嚴重的大豆苗期害蟲之一，由于化學防治造成的害蟲抗藥性、農(nóng)藥殘留等問題，加速了生物防治被推廣和應用的進程。在大豆蚜生物防治措施中，發(fā)揮天敵的控害作用是近幾年來最受關(guān)注的防治策略。利用大豆蚜捕食性天敵進行生物防治首先要明確大豆蚜天敵的優(yōu)勢種群，在此基礎(chǔ)上量化評估天敵對大豆蚜有多大的捕食和控制能力，進而制定出切實可行的防治措施。
　　 本研究在分析大豆蚜細胞色素

2、氧化酶Ⅱ（COⅡ）基因序列基礎(chǔ)上，設(shè)計特異性引物，以大豆蚜成蟲及取食過大豆蚜的捕食性天敵總RNA為模板，通過RT-PCR獲得COⅡ基因的DNA片段，用T-A克隆方法將其裝載到質(zhì)粒pMD18-T載體上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取獲得標準品，并以此為模板梯度稀釋進行Real-time PCR反應，建立檢測大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)的標準曲線，并對田間捕食性天敵腹內(nèi)目標害蟲成分進行檢測分析，最后擬合天敵發(fā)生數(shù)量、陽性天敵比率、天敵體內(nèi)目標害蟲成分含量及目

3、標害蟲在天敵體內(nèi)衰變速率，綜合評價異色瓢蟲幼蟲、龜紋瓢蟲幼蟲、大草蛉幼蟲和小花蝽幼蟲對大豆蚜的控制能力，為大豆蚜的生物防治提供理論依據(jù)。
　　 本試驗主要研究結(jié)果如下：
　　 1）設(shè)計合成大豆蚜特異性引物，驗證該引物對大豆蚜及其同時期發(fā)生的其他蚜蟲種類包括茄無網(wǎng)長管蚜、桃蚜、玉米蚜、禾谷縊管蚜、麥長管蚜沒有擴增效果，且電泳檢測結(jié)果顯示引物特異性良好，可用于熒光定量PCR反應。
　　 2）利用PCR技術(shù)初步檢測捕食

4、性天敵對大豆蚜的捕食作用，在田間隨機采集的不同種類天敵，包括異色瓢蟲成蟲及幼蟲、龜紋瓢蟲成蟲及幼蟲、大草蛉成蟲及幼蟲、小花蝽成蟲及幼蟲，結(jié)果表明，在不同蟲態(tài)上并不能完全檢測到大豆蚜COⅡ基因片段，以檢出率做為標準，同種天敵幼蟲期對大豆蚜捕食作用檢出率較成蟲期高，在所檢測的4種捕食性天敵類群及其不同蟲態(tài)中，異色瓢蟲幼蟲、龜紋瓢蟲幼蟲、大草蛉幼蟲及小花蝽成蟲和幼蟲對大豆蚜的捕食作用檢出率分別為：80％、66.7％、73.3％、56％、60％

5、。
　　 3）成功構(gòu)建利用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR技術(shù)檢測大豆蚜COⅡ基因表達的標準曲線，通過對標準曲線、擴增曲線及熔解曲線分析，結(jié)果表明目的基因拷貝數(shù)與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，反應特異性較強，無引物二聚體出現(xiàn)，可用于其他樣品的檢測。
　　 4）利用熒光定量PCR反應體系和程序?qū)Σ妒承蕴鞌酬栃苑磻獋€體體內(nèi)大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)進行檢測。結(jié)果表明，異色瓢蟲幼蟲體內(nèi)含有的大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)最大；其次為大草

6、蛉幼蟲；再次為龜紋瓢蟲幼蟲；小花蝽幼蟲體內(nèi)含有的大豆蚜COⅡ基因拷貝數(shù)最少。
　　 5）檢測取食過大豆蚜自然消化不同時間的天敵體內(nèi)COⅡ基因衰變規(guī)律表明，隨著消化時間的延長，可檢測到大豆蚜目的片段的陽性個體數(shù)逐漸減少，并且捕食者體內(nèi)目的基因片段的拷貝數(shù)也隨消化時間的延長而減少。并計算出各天敵取食大豆蚜后消化時間對拷貝數(shù)對數(shù)的相關(guān)關(guān)系式，異色瓢蟲幼蟲取食大豆蚜，自然消化0、2、4、6h后時間對拷貝數(shù)對數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：A=-0.6

7、517B+3.3024（R2=0.983）；龜紋瓢蟲幼蟲取食大豆蚜自然消化時間對拷貝數(shù)對數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：C=-0.4824D+3.2952（R2=0.965）；大草蛉幼蟲取食大豆蚜自然消化時間對拷貝數(shù)對數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：E=-0.4715F+3.4319（R2=0.975）；小花蝽幼蟲取食大豆蚜自然消化時間對拷貝數(shù)對數(shù)的相關(guān)關(guān)系式為：G=-0.4464H+3.2439（R2=0.939）。
　　 6）綜合考慮采集天敵數(shù)量、天敵