害蟲捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體毒理學特性研究.pdf

1、蜘蛛作為農(nóng)田害蟲最重要的捕食性天敵，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中節(jié)肢動物群落的優(yōu)勢類群，其群落結構與功能的特性直接制約著害蟲的發(fā)生與危害，影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑對蜘蛛類天敵安全，對蜘蛛的毒性明顯小于甲胺磷和撲虱靈。雖然蜘蛛在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中占有很重要的生態(tài)位，但是，對于其新煙堿類殺蟲劑的靶標--煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors， nAChRs)的研究至今仍是空白。形成鮮

2、明對比的是，對昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的研究近年來取得了很好的進展，這與新煙堿類殺蟲劑的廣泛使用相關。新煙堿類殺蟲劑不僅毒力高，同時具備很高的選擇性、安全性，對哺乳動物、天敵蜘蛛比較安全。這些應用上的價值和毒理學特性上的差異，都促使人們思索并研究新煙堿類殺蟲劑的選擇性機理，加以應用于開發(fā)更好的選擇性殺蟲劑。
　　 本文以稻田蜘蛛的優(yōu)勢種、重要的捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛為材料，克隆了擬環(huán)紋豹蛛多個nAChRs亞基，通過與昆蟲nAChRs

3、相同亞基相比，探索了新煙堿類殺蟲劑在昆蟲與蜘蛛間的毒理學差異，闡述基于β亞基的選擇性機理；對亞基組合進行了探索，分析受體的亞基組成與昆蟲nAChRs亞基組成的差異，進一步探索新煙堿類殺蟲劑選擇作用的分子機制，同時為新型高效高選擇性的殺蟲劑的創(chuàng)制提供理論基礎。
　　 一、擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體基因的克隆
　　 采用簡并引物PCR和RACE技術首次克隆了害蟲主要捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛7個煙堿型乙酰膽堿受體基因，這也是首次

4、關于蛛形綱nAChRs的報道。其中包括6個全長基因和一個5’-端不全的長片段。通過與昆蟲nAChRs亞基序列比對和分析，發(fā)現(xiàn)這些基因與昆蟲的nAChRs亞基具有很高的同源性，其中5個亞基具有煙堿型乙酰膽堿α亞基的典型特征，2個具有β亞基的典型結構，此外，7個亞基基因結構特征分析也顯示，它們均具有煙堿型乙酰膽堿受體亞基的典型特征，如保守的半胱氨酸(α亞基還具有典型的雙半胱氨酸結構)、與配基結合密切相關的保守氨基酸殘基形成的環(huán)[loopA-

5、C(α亞基),loopD-F(β亞基)]、4個跨膜片段、信號肽以及糖基化位點等。因此，根據(jù)系統(tǒng)進化關系，分別將這7個基因命名為Ppα1、Ppα2、Ppα3、Ppα6、Ppα7(5’-端不全)、Ppβ1和Ppβ2。
　　 通過對擬環(huán)紋豹蛛nAChRsβ1亞基Ppβ1與昆蟲nAChRsβ1亞基氨基酸序列的比對，發(fā)現(xiàn)Ppβ1與昆蟲的β1亞基具有很高的同源性，但是與配基結合密切相關的D,E和F環(huán)上有幾個重要的氨基酸存在著差異。本文通過Y

6、ao等（2008年）把桃蚜的β1亞基Mpβ1的三個環(huán)D、E和F構建到鼠的β2亞基上，形成嵌合體β2Mββ1的方法，把Ppβ1亞基的D、E、F環(huán)替代桃蚜β1亞基相應的部分，與哺乳動物β亞基重組與昆蟲的α亞基構建嵌合體在非洲爪蟾卵母細胞中共表達，研究了擬環(huán)紋豹蛛β1亞基D、E、F環(huán)以及環(huán)上一些關鍵氨基酸變化的影響。
　　 結果顯示，與桃蚜嵌合體β2Mpβ1相比，把β2Mpβ1的D、E、F三個環(huán)單獨或一起由Ppβ1亞基相應的環(huán)替代后，

7、吡蟲啉的劑量曲線均發(fā)生了顯著的右移，而對ACh卻幾乎沒有影響。進一步的研究顯示，與配基結合密切相關的D、E、F環(huán)上的單個氨基酸的改變R81Q、N137G和F190W可能是敏感性發(fā)生變化的主要因素。這是首次在蛛形綱體內(nèi)找到與新煙堿類殺蟲劑選擇性相關的氨基酸位點。
　　 三、擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體的亞基組成
　　 脊椎動物nAChRs受體可以以雙型“pair”、三型“triplet”、四型“quadruplet”方式組

8、合，也可以由同一個亞基組成同型五聚體（Papke et al.，1989; Kuryatov etal.，2000; Mishina et al.,1986; Couturier et al.,1990）。而在昆蟲nAChRs亞基功能研究中，關于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中nAChRs的亞基組成，即nAChRs五聚體功能單位到底是哪些亞基構成的問題始終沒有解決，對昆蟲nAChRs亞基進行各種組合都沒能表達出受體功能，即使將來自于同一種昆蟲的所有亞基共

9、同表達仍然不成功( Millar，2003)。
　　 本文對已克隆的擬環(huán)紋豹蛛的2個α亞基（Ppα1, Ppα2）及2個β亞基(Ppβ1，Ppβ2)進行了體外表達，結果表明，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母細胞異源表達系統(tǒng)中，Ppα1， Ppα2與脊椎動物的β2亞基共表達，能夠組成一個三亞基五聚體受體Ppα1/Ppα2/rβ2。免疫共沉淀的研究結果表明，在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Ppα1, Ppα2, Ppβ1及Ppβ2四個