狂犬病病毒強弱毒株感梁鼠腦mRNA差異顯示研究.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV）引起溫血動物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的一種重要的人獸共患傳染病，以急性、幾乎不可逆轉(zhuǎn)的腦脊髓炎為主要病理特征，以狂躁不安，行為反常、進(jìn)行性麻痹和最終死亡為主要臨床特征。目前尚無有效治療方法，病死率幾乎100％。我國是受狂犬病危害最為嚴(yán)重的國家之一，近年報告狂犬病死亡人數(shù)均在2400人以上，一直居我國各類傳染病報告死亡數(shù)的前三位。
　　 盡管病毒學(xué)實驗技術(shù)在過去半個多

2、世紀(jì)中有了很大的發(fā)展，人們對狂犬病病毒及其結(jié)構(gòu)蛋白在致病過程中的角色也有了一定的認(rèn)識。但是人們對狂犬病致病機制以及宿主因素對狂犬病病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響仍然不清楚?？袢〔《镜母腥臼遣《九c宿主相互作用的結(jié)果，包括病毒在體內(nèi)復(fù)制和擴散、病毒對細(xì)胞的致病效應(yīng)，以及抗病毒應(yīng)答反應(yīng)等。對基因表達(dá)的差異及其表達(dá)產(chǎn)物的功能分析表明，鼠腦中某些宿主基因可能與狂犬病病毒復(fù)制和擴散有關(guān)。
　　 用于鑒定基因不同表達(dá)的方法較多，如削減雜交(SH)、限

3、制性片段差異顯示(RFDD)、cDNA排列雜交、差異顯示(DD)等，這些技術(shù)已用于查找病毒復(fù)制周期中相關(guān)宿主基因、抗病毒防御相關(guān)基因以及非特異性免疫反應(yīng)的相關(guān)基因。其中差異顯示反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(DDRT-PCR)因其操作簡單、易獲結(jié)果等特點，在病毒學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。
　　 為了闡明RV不同毒力株感染鼠腦一定時間后基因表達(dá)的差異，并進(jìn)一步揭示RV感染的分子機制和抗感染應(yīng)答，本研究利用成年（20g左右）Balb/c小鼠作為

4、模型動物，通過DDRT-PCR技術(shù)分析了RV疫苗弱毒株(SRV9)，街毒強毒株(BD06)感染鼠腦后引起的基因水平變化，結(jié)合差異表達(dá)基因及相關(guān)蛋白的已知功能，分析了其可能存在的作用機制。試驗將30只Balb/c成年鼠隨機分為三組:BD06、SRV9和Control，腦內(nèi)注射后48h和72h，分別從各組中取3只小鼠，眼球放血致死，取全腦組織，提取組織總RNA并以過量DNaseI消化，以消除DNA污染。根據(jù)真核生物基因組具有PolyA尾的結(jié)

5、構(gòu)特點，設(shè)計3’端錨定引物H-T11-M（M代表A、C、G）與5，端隨機引物（AP1-AP8），通過錨定引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，找出差異條帶并切膠回收。回收產(chǎn)物重擴增后，將陽性產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳回收，克隆至pMD-18T載體并測序，對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，查找到其對應(yīng)的基因及其所表達(dá)蛋白。
　　 通過對同一個體不同PCR產(chǎn)物的

6、橫向重復(fù)比較，以及不同個體之間的縱向重復(fù)比較，結(jié)合回收產(chǎn)物重擴增篩選，在病毒感染后48h的樣品中找到了的11條差異表達(dá)條帶，在病毒感染72h樣品中找到了9條差異條帶，其中，與其余兩組比較，SRV9組上調(diào)表達(dá)的有7條，BD06組上調(diào)表達(dá)的有2條，Control組有1條差異表達(dá)片段;與對照組相比，SRV9與BD06組有7對共同上調(diào)表達(dá)片段，這些差異片段所屬mRNA及其表達(dá)蛋白在細(xì)胞的一些功能方面發(fā)揮著重要的作用，其中包括執(zhí)行各種功能的多個酶

7、類，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成和信號傳導(dǎo)、細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、核酸代謝以及蛋白加工等生物過程的多種功能蛋白。進(jìn)一步分析這些差異蛋白在RV感染中的功能，有利于揭示不同毒力RV致病性差異的根源。
　　 本研究獲得了較為完整的RV感染鼠腦的差異表達(dá)mRNA及其相應(yīng)蛋白的數(shù)據(jù)，顯示了宿主細(xì)胞對不同毒力RV感染早期的不同應(yīng)答，對相關(guān)差異表達(dá)蛋白在RV的感染和復(fù)制過程中的具體功能進(jìn)一步研究，將為揭示RV感染、毒力差異和分子致病機制奠