我國狂犬病流行毒株馴化及高效佐劑疫苗研究.pdf

1、在我國,每年被犬咬傷的人數(shù)多達1千萬以上,并因此導致至少2000～3000人死于狂犬病。國產(chǎn)滅活疫苗發(fā)展緩慢是我國人狂犬病持續(xù)多發(fā)的原因之一。我國犬的狂犬病疫苗產(chǎn)品供應多年來一直依賴少量進口滅活疫苗和國產(chǎn)弱毒活疫苗。目前,進口疫苗供應量只能占總需求量的1～3％,弱毒疫苗由于安全性問題在發(fā)達國家早已不再用于家畜動物免疫,少數(shù)幾家國產(chǎn)滅活疫苗產(chǎn)品雖然在近幾年已完成注冊,但由于效力和成本等各種原因遲遲未能上市或剛剛啟動生產(chǎn),而且產(chǎn)能有限,其數(shù)

2、量和質(zhì)量遠不能保證有效免疫的高覆蓋率。因此,提高細胞培養(yǎng)狂犬病病毒的產(chǎn)毒滴度和研制高效疫苗佐劑,是我國動物狂犬病滅活疫苗研究的兩個主要方向,也是解決疫苗效力和生產(chǎn)成本問題的重要途徑。
　　針對上述問題,本研究開展了以下試驗:
　　1.我國狂犬病病毒流行毒株的細胞馴化。試驗內(nèi)容:①毒株的細胞培養(yǎng)。對分離自我國江西地區(qū)的一株鼬獾狂犬病病毒JX08-45株在BHK-21細胞上進行連續(xù)傳代和培養(yǎng)滴度(TCID50)測定。②病毒細胞適

3、應株的致病性檢測。以腦內(nèi)和肌肉注射途徑,分別在犬和小鼠進行病毒致病性檢測。③全基因組測序分析。對病毒適應細胞培養(yǎng)前后的全基因組核苷酸和氨基酸變化進行分析,并與其他疫苗株和流行株進行比對,從而確定影響病毒細胞適性的關(guān)鍵氨基酸位點。④免疫原性檢測。通過小鼠免疫試驗,對該細胞適應株和其他疫苗株的滅活后免疫原性進行比較,評價本毒株的免疫原性。
　　2.狂犬病疫苗佐劑的研制。試驗內(nèi)容:①新型佐劑和免疫增強劑的篩選。進行一系列佐劑的制備,利用

4、小鼠免疫試驗和狂犬病中和抗體滴度測定,對佐劑的免疫增強作用進行檢測,篩選出適用于狂犬病滅活疫苗的高效佐劑。②佐劑的作用機制研究。通過淋巴細胞增殖試驗、血液Th/Tc細胞亞群鑒定和細胞因子檢測,對佐劑誘導的免疫類型及增強抗體反應的機制進行研究。③佐劑的安全性評價。通過超劑量接種,檢測小鼠的生長發(fā)育和生育能力變化,以及內(nèi)臟組織的病理學變化。
　　3.高效佐劑狂犬病疫苗的研制。試驗內(nèi)容:①疫苗的制備。通過在小鼠和犬的免疫效果評價,確定病

5、毒的最佳培養(yǎng)工藝和佐劑/抗原的最佳配比,并進行三批實驗室產(chǎn)品的制備。②疫苗的安全性評價。通過在犬的超劑量免疫,檢測疫苗對犬內(nèi)臟組織、體溫、行為和飲食的影響。③與國內(nèi)同類疫苗產(chǎn)品免疫效果的比較。通過在犬的免疫試驗,對國內(nèi)使用的進口疫苗和本疫苗誘導的體液免疫水平進行檢測和比較。④疫苗效力檢測方法的建立。利用狂犬病中和抗體標準檢測方法(FAVN法),建立適用于本疫苗效力檢驗的小鼠血清學疫苗效力測定方法,并對其檢測的準確性和可重復性進行驗證。<

6、br>　　通過以上試驗,獲得以下結(jié)果:
　　1.細胞馴化結(jié)果顯示,病毒在BHK-21傳至120代時增殖滴度能達到108.0TCID50/mL,并將其重新命名為JX08-45CC株。JX08-45CC株腦內(nèi)接種可使小鼠100%致死,外周攻毒僅能使部分小鼠死亡,但外周接種對犬不致病。JX08-45CC適應細胞后基因組中共發(fā)生了17個核苷酸位點的突變和7個氨基酸突變,其中6個氨基酸突變點在G蛋白,但并未改變其中和抗原表位和主要的毒力相關(guān)

7、位點。6個G蛋白氨基酸突變點中,有4個位點與其他疫苗株序列一致,其中2個位點與流行株序列不同。JX08-45CC株滅活后的免疫原性與國內(nèi)使用的疫苗株相比,在相同病毒滴度下不低于現(xiàn)有疫苗株。
　　2.免疫佐劑的制備研究結(jié)果顯示,以水包油型佐劑和黃芪多糖為佐劑的疫苗,能誘導產(chǎn)生顯著高于普通氫氧化鋁佐劑疫苗的狂犬病中和抗體,而且多糖能加速疫苗誘導的體液免疫應答。佐劑接種對小鼠發(fā)育和生育能力無明顯影響,對小鼠主要內(nèi)臟未造成損傷。水包油型佐

8、劑和黃芪多糖均可刺激淋巴細胞明顯增殖,能誘導血液中Th1/Tc1細胞亞群的極化和多種細胞因子(IL-1β、IL-5、IL-6、MCP-1、GM-CSF和IFN-α)水平上調(diào),主要通過誘導細胞免疫增強機體的抗體反應水平。
　　3.高效佐劑疫苗研究結(jié)果顯示,病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)條件:5%同步接種,37℃培養(yǎng)4h,34℃培養(yǎng)7～8天;并確定疫苗配制體積比(佐劑:病毒液)為1:4,黃芪多糖在疫苗的工作濃度為10mg/mL。根據(jù)以上確定的疫苗配制

9、方案,完成了3批實驗室狂犬病滅活疫苗(JX08-45CC株)制備(批號:201001Vac、201002Vac和201003Vac),疫苗效力分別為3.15IU/mL、3.10IU/mL和3.05IU/mL。本疫苗對犬生長發(fā)育和主要臟器均無明顯影響。本疫苗在犬誘導的抗體水平總體高于目前國內(nèi)使用的進口疫苗,對攻毒犬具有完全保護能力。根據(jù)疫苗生產(chǎn)需要,建立了一種快速、簡便的半定量檢測疫苗效力的小鼠血清學方法,具有周期短、成本低、重復性好的特

10、點,適用于生產(chǎn)中疫苗效力檢驗。
　　通過以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:
　　1.獲得一株適應BHK-21細胞高滴度培養(yǎng)的狂犬病病毒JX08-45CC株,其致病性和基因組序列變化等背景清楚,免疫原性強,具備疫苗候選株的基本條件。
　　2.制備了兩種用于狂犬病滅活疫苗的佐劑,闡明了佐劑通過誘導細胞免疫增強體液免疫的基本作用機制,并證明其免疫增強作用顯著、安全性良好,制備工藝簡單,適用于獸用狂犬病疫苗生產(chǎn)。
　　3.利用馴化

11、毒株和兩種佐劑研制了狂犬病滅活疫苗(JX08-45CC株),其制備工藝簡單、效力檢驗方法簡便、生產(chǎn)成本低廉、安全性良好、免疫效力較高,符合我國犬狂犬病免疫的現(xiàn)實需求。
　　論文創(chuàng)新點:
　　1.為我國獸用疫苗生產(chǎn)獲得了第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)、培養(yǎng)滴度高、免疫原性好的狂犬病疫苗候選株。
　　2.研制出用于狂犬病滅活疫苗的新型佐劑,闡明了其基本作用機制,并證明具有顯著免疫增強作用,適用于狂犬病滅活疫苗生產(chǎn)。
　　3.