野大豆堿脅迫轉錄譜與基因組整合分析.pdf

1、松嫩平原西部地區(qū)是世界三大堿土集中分布區(qū)之一，面積高達373萬h㎡。在這樣的土壤環(huán)境下，植物遭受著鈉離子毒害、碳酸氫根離子毒害和pH升高引起的土壤物理性質(zhì)變化，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。迫切需要通過基因工程技術改良作物的耐堿能力。挖掘耐堿基因，揭示其分子機理，是耐堿分子育種的重要前提。野大豆可以耐受9.02的pH環(huán)境，是進行植物耐堿功能基因組學的理想材料。
　　 本研究以采自吉林省白城市鹽堿地的耐堿野大豆為試材，結合基因芯片技術構建堿脅

2、迫基因轉錄譜，采用生物信息學手段，結合野大豆基因組數(shù)據(jù)，分析堿脅迫應答基因的共表達特征、染色體聚簇和上游調(diào)控區(qū)特征，揭示堿脅迫應答分子機制，篩選耐堿候選基因。通過本研究，將加深對植物耐堿分子機理的認識，為作物耐堿分子育種提供基因資源和奠定理論基礎。本研究的主要研究結果如下：
　　 1.野大豆堿脅迫基因轉錄譜的建立
　　 用50mmol/L，NaHCO3模擬堿脅迫，處理野大豆G07256，提取RNA，與Affymetrix

3、公司的基因芯片進行雜交，獲得了雜交質(zhì)量高、重復性好的野大豆堿脅迫基因轉錄譜。該轉錄譜包括脅迫前和脅迫后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h共7個時間點，根部23741個和葉部22200個轉錄本。
　　 采用實時熒光定量PCR技術對芯片雜交結果進行了驗證。隨機選擇的24個基因的變化趨勢與芯片結果一致，表明芯片雜交結果能夠真實地反映基因的轉錄水平變化。
　　 2.野大豆堿脅迫應答基因的獲得
　　 采用RankP

4、rod統(tǒng)計方法分析每兩個時間點間基因表達量的差異顯著性（p<0.01，pfp<0.15），篩選出在某兩個時間點間發(fā)生了顯著變化的基因，即堿脅迫應答基因，根部2493個，葉部2310個。通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，根中參與代謝過程基因顯著為堿脅迫應答基因，葉中參與代謝過程和膜轉運相關的基因顯著為堿脅迫應答基因。
　　 在6h出現(xiàn)堿脅迫基因應答高峰。在根中，參與細胞結構建成、疾病與防御、次生代謝和轉錄相關途徑的基因顯著早期應答，在轉錄相關

5、基因中富集了WRKY轉錄因子。在葉中，參與細胞結構建成、蛋白質(zhì)合成、能量和次生代謝相關基因顯著早期應答。利用堿脅迫前6h轉錄譜構建基因調(diào)控網(wǎng)絡，鑒定出28個堿脅迫應答關鍵基因。
　　 3.野大豆堿脅迫下共表達基因及特征
　　 為揭示堿脅迫應答基因的共表達特征，采用適合短時間序列表達數(shù)據(jù)的聚類方法STEM進行了聚類分析。發(fā)現(xiàn)根中有11類基因，葉中有10類基因具有顯著的共表達特征（p<0.001）。共表達基因通常包含類似功能

6、的基因，上游調(diào)控區(qū)具有共同的調(diào)控元件。共表達特性與其在基因組上的分布不存在相關性。發(fā)現(xiàn)共表達基因啟動子中有21個motif對基因的共表達起重要作用，其中有12個是已知的順式作用元件。
　　 4.堿脅迫應答miRNA篩選及調(diào)控作用分析
　　 通過將miRNA前體序列與芯片上探針組和大豆基因序列進行BLASTn比對，發(fā)現(xiàn)有38個轉錄本能夠代表miRNA前體。獲得了根和葉中各11條堿脅迫應答miRNA，其中7條尚未有脅迫應答的

7、報道，為新發(fā)現(xiàn)的堿脅迫應答miRNA。預測miRNA靶基因，發(fā)現(xiàn)堿脅迫應答的miRNA主要通過調(diào)控轉錄因子和激酶基因影響植物的堿脅迫應答。
　　 5.野大豆耐堿候選基因篩選
　　 通過堿脅迫應答基因與分子標記的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了1個功能未知基因和1個具有亮氨酸拉鏈和絲蘇氨酸磷酸轉移酶活性的基因位于耐鹽堿分子標記附近。根據(jù)基因的堿脅迫應答情況及功能注釋，從堿脅迫應答基因中篩選出2個耐鹽堿分子標記附近基因，435個有明確結構域