激活蛋白AP-2asiRNA電轉(zhuǎn)染牛雙核滋養(yǎng)層巨細胞對其特異表達基因轉(zhuǎn)錄水平的影響.pdf

1、為探討轉(zhuǎn)錄激活蛋白2α(activator protein-2α,AP-2α,TFAP2A)對牛雙核滋養(yǎng)層巨細胞(binucleate trophoblast giant cells,BNC)特異表達基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,本實驗培養(yǎng)了牛原代滋養(yǎng)層巨細胞,對其進行了核染色和細胞免疫化學(xué)染色鑒定,以建立細胞模型進行體外實驗。采用電轉(zhuǎn)技術(shù)將化學(xué)合成AP-2αsiRNA導(dǎo)入原代細胞,用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測干擾效率,采用臺盼藍染色檢測細胞存活

2、率,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以找到最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)；采用熒光定量PCK檢測AP-2αsiRNA對內(nèi)源TFAP2A的干擾效率,篩選出最佳干擾位點；最后采用熒光定量PCR分別檢測干擾后BNC特異表達基因Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。
　　 本研究主要分為兩個部分:
　　 一、牛滋養(yǎng)層巨細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 取懷孕牛45-60天的完整子宮,無菌條件下收集胚胎子葉,Ⅰ型膠原酶消化分離細胞后采用Percoll細胞分離液純

3、化滋養(yǎng)層細胞。用含15％胎牛血清和滋養(yǎng)層細胞生長添加劑(trophoblast growth supplement,TGS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,并用差異貼壁法再次進行純化。采用臺盼藍和Hoechst33342細胞染色液對細胞活力及形態(tài)學(xué)進行分析。采用波形蛋白和角蛋白免疫細胞化學(xué)法進行鑒定。結(jié)果顯示,本實驗分離的細胞經(jīng)臺盼藍染色后細胞存活率大于90％,用Percoll細胞分離法純化后BNC的純度可達30％,細胞培養(yǎng)10天后,BNC占

4、細胞總數(shù)的45-50％?？辜毎堑鞍卓贵w檢測呈陽性,抗波形蛋白抗體檢測呈陰性,經(jīng)核染可見典型雙核特征。本實驗建立了一種相對快速、簡便、能夠培養(yǎng)相對較高純度的牛原代胚胎滋養(yǎng)層巨細胞的方法。
　　 二、AP-2αsiRNA電轉(zhuǎn)染原代BNC細胞
　　 培養(yǎng)后第10天收獲細胞,將化學(xué)合成的AP-2αsiRNA干擾鏈,采用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入純化后的BNC,首先轉(zhuǎn)入帶熒光標記基團的siRNA(NC-siRNA-FAM),4小時后用流式細胞

5、儀和臺盼藍染色分別檢測轉(zhuǎn)染效率和細胞活率。再轉(zhuǎn)入不同位點的干擾鏈,48小時后用實時熒光定量PCR檢測AP-2αmRNA水平,以篩選出最佳干涉位點。以最佳干涉位點的siRNA進行實驗,即轉(zhuǎn)入該siRNA干擾鏈,48小時后RT-PCR測定Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。本研究采用電轉(zhuǎn)染方法,結(jié)果顯示,最佳優(yōu)化條件為:細胞密度調(diào)整為500μl PBS含2×106個細胞,加入6μgNC-siRNA-FAM,電轉(zhuǎn)參數(shù)為2×120V,

6、2ms。在此參數(shù)下陽性細胞率達到93.5±1.66％,且細胞存活率為78.56±5.93％。初步建立了有效的siRNA電轉(zhuǎn)入牛滋養(yǎng)層巨細胞的方法。PCR結(jié)果顯示,與對照組和ns-siRNA組相比,AP-2αsiRNA干擾效率可迭72.30±3.28％,差異極顯著(P<0.01),轉(zhuǎn)染后內(nèi)源性Csh1和PRP-Ⅰ的mRNA水平分別下降了65.45±6.38％,40.73±11.72％,差異極顯著(P<0.01)；而PAG1的mRNA水平減