人巨細(xì)胞病毒對早孕絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞功能影響的體外研究.pdf

1、目的：觀察人巨細(xì)胞病毒（HCMV）對早孕絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（EVT）的增殖和侵襲功能的影響，初步探討HCMV 對EVT 侵襲活力影響的可能機(jī)制。
　　 方法：無菌采集健康孕婦早孕絨毛，通過復(fù)合酶消化梯度離心法分離培養(yǎng)原代EVT及體外培養(yǎng)絨毛組織；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測細(xì)胞角蛋白7（CK7）、波形蛋白（Vim）和c-erbB-2 鑒定細(xì)胞來源，吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)；擴(kuò)增HCMV后測定TCID50；將HCMV 接種于原代EVT、絨

2、毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株HPT-8和絨毛組織培養(yǎng)基，采用免疫熒光（或組織）化學(xué)染色檢測細(xì)胞及絨毛組織內(nèi)HCMVpp65抗原表達(dá)，確定細(xì)胞及組織HCMV 感染情況；通過MTT 法檢測HCMV 對HPT-8 增殖活性的影響，確定實(shí)驗(yàn)最佳病毒接種量；實(shí)驗(yàn)分為正常組（原代EVT、HPT-8、villous explant）和病毒組（原代EVT+HCMV、HPT-8+HCMV、villous explant+HCMV），原代EVT、HPT-8和絨毛組織培養(yǎng)

3、基內(nèi)接種HCMV48h后，采用免疫細(xì)胞（組織）化學(xué)染色SP 法和Western blot，檢測原代EVT、HPT-8 及絨毛組織各實(shí)驗(yàn)組c-erbB-2、TGF-β1、Smad7、MMP-2和MMP-9等侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平；明膠酶譜法檢測HCMV 對原代EVT和HPT-8分泌的MMP-2及MMP-9 酶活性的影響；體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HCMV對原代EVT和HPT-8 侵襲功能的影響。
　　 結(jié)果：細(xì)胞來源鑒定結(jié)果示，幾乎所有分

4、離培養(yǎng)細(xì)胞均表達(dá)CK7和c-erbB-2，偶表達(dá)Vim，提示原代培養(yǎng)獲得細(xì)胞為高純度的EVT；吉姆薩染色見細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞為主，多為三角形和不規(guī)則形，細(xì)胞聚集但不融合；早孕絨毛組織體外培養(yǎng)48h后，組織學(xué)檢測結(jié)果示絨毛組織結(jié)構(gòu)正常，未見組織壞死及溶解；病毒擴(kuò)增后測定HCMVTCID50 為10-5.46/0.1ml；原代EVT 及HPT-8細(xì)胞培養(yǎng)基接種病毒后，細(xì)胞內(nèi)均可見大量紅色HCMVpp65抗原信號(hào)，未加病毒的細(xì)胞內(nèi)未見紅色信號(hào)；

5、病毒組絨毛組織內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（CT）、合體滋養(yǎng)細(xì)胞（ST）、間質(zhì)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)小血管周圍均出現(xiàn)HCMVpp65信號(hào)，正常組未見陽性信號(hào)；HCMV 對HPT-8 增殖功能影響結(jié)果示，與正常組比較，接種病毒48h 時(shí)，20ul、30ul、40ul HCMV 病毒液對HPT-8增殖有明顯抑制作用（P<0.05），其各組間無明顯差異（P>0.05）；原代EVT 及HPT-8細(xì)胞均表達(dá)c-erbB-2、TGF-β1、Smad7、MMP-

6、2和MMP-9等蛋白，與正常組比較，感染組c-erbB-2、Smad7、MMP-2和MMP-9 蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P<0.05）；體外絨毛組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，c-erbB-2 蛋白主要在正常早孕絨毛ST 遠(yuǎn)端質(zhì)膜、EVT 尤其是絨毛干細(xì)胞柱中遠(yuǎn)端細(xì)胞膜表達(dá)，ST近端胞膜及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見少量表達(dá)。TGF-β1 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞柱和島、ST和EVT。Smad7 蛋白表達(dá)于CT和ST。MM

7、P-2蛋白主要在早孕絨毛EVT 胞漿表達(dá)，VT、ST 及間質(zhì)有少量表達(dá)。MMP-9 蛋白主要在早孕絨毛間質(zhì)、EVT和VT 胞漿表達(dá)，ST 少量表達(dá)。與正常組相比，病毒組絨毛組織c-erbB-2、Smad7、MMP-2和MMP-9等蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而TGF-β1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P<0.05）；原代EVT和HPT-8細(xì)胞在體外均分泌具有活性的MMP-2和MMP-9，HCMV 感染兩種細(xì)胞24h后，MMP-2和MMP-9 活

8、性均明顯降低，P<0.05；原代EVT和HPT-8細(xì)胞均有細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠，原代EVT的正常組和病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（57.0±3.61）個(gè)和（49.2±3.27）個(gè)（P<0.05），HPT-8細(xì)胞的正常組和病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（76.4±6.23）個(gè)和（55.2±4.60）個(gè)（P<0.05），提示HCMV 降低EVT 侵襲活力。
　　 結(jié)論：原代分離培養(yǎng)EVT和體外絨毛培養(yǎng)可作為HCMV 宮內(nèi)感染體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>