牛類滋養(yǎng)層干細(xì)胞建系的研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，胚胎細(xì)胞第一次分化形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層。滋養(yǎng)層干細(xì)胞（trophoblast stem cells，TSC）是胎盤細(xì)胞的前體細(xì)胞，在胎盤發(fā)育中有重要作用。有蹄類滋養(yǎng)層干細(xì)胞的建系是公認(rèn)的難點(diǎn)，目前僅在山羊、牛、豬等有蹄類動(dòng)物獲得滋養(yǎng)層細(xì)胞的報(bào)道，但這些研究并沒(méi)有對(duì)這些細(xì)胞系多潛能性或干細(xì)胞的特征進(jìn)行全面鑒定。因此這些細(xì)胞系可能處于有別于TSC的分化階段。本研究比較了不同培養(yǎng)體系對(duì)牛類滋養(yǎng)層干細(xì)胞(bovin

2、etrophoblast stem-like，bTS)建系的影響，特別對(duì)利用2i(PD0325901和CHIR99021)獲得的牛類滋養(yǎng)層干細(xì)胞bTS進(jìn)行了鑒定，包括堿性磷酸酶檢測(cè)、核型分析、干細(xì)胞多能性標(biāo)志物基因表達(dá)情況和分化潛能的檢測(cè)，以確定bTS是否為典型的牛類滋養(yǎng)層干細(xì)胞。我們采用寡聚核苷酸芯片檢測(cè)了約23000個(gè)牛的轉(zhuǎn)錄物，還分別對(duì)干細(xì)胞多潛能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、SOX2、CDX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況進(jìn)行了初

3、步分析。主要研究成果如下:
　　1不同的培養(yǎng)體系對(duì)牛類滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)和建系的影響
　　以DMEM/F12+ Neurobasal Medium+N2B27或單獨(dú)使用DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加2i、FGF或Wnt3a，分別以L Wnt-3A/MEF混合細(xì)胞或BFF作為飼養(yǎng)層，探討不同的培養(yǎng)體系對(duì)牛滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)和建系的影響。結(jié)果表明:2i培養(yǎng)液結(jié)合L Wnt-3A/MEF和添加Wnt3a的2i培養(yǎng)液結(jié)合BFF兩個(gè)

4、培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的bTS具有典型的類似小鼠TSC的形態(tài)，呈單層扁平生長(zhǎng)，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)沒(méi)有明顯的形態(tài)變化，所建的細(xì)胞系最長(zhǎng)已傳至170代;而在去除小分子PD0325901并添加FGF的培養(yǎng)體系，無(wú)論使用L Wnt-3A/MEF或BFF作為飼養(yǎng)層，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，雖然形態(tài)類似小鼠ESC，呈三維立體生長(zhǎng)，但均未能傳過(guò)18代。
　　2 bTS細(xì)胞系滋養(yǎng)層干細(xì)胞基本特性的鑒定
　　本研究利用2i培養(yǎng)液結(jié)合L Wnt-3A/MEF所建立的細(xì)

5、胞系BTS-1具有正常的二倍體核型。在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中，該細(xì)胞系保持了未分化狀態(tài)，堿性磷酸酶檢測(cè)呈陽(yáng)性，表達(dá)干細(xì)胞多能基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-1和SSEA-4。同時(shí)表達(dá)TSC標(biāo)志基因CDX2、TEAD4、EOMES、ELF5、GATA3、SMARCA4(BRG1)、 ETS2和ERR2。bTS細(xì)胞體外可分化為類胚體或貼壁生長(zhǎng)并形成雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞。分化的細(xì)胞中檢測(cè)到滋養(yǎng)層分化標(biāo)志物H

6、AND1、MASH2和PL-1表達(dá)上調(diào)。在畸胎瘤實(shí)驗(yàn)中，bTS細(xì)胞能在NOD-SCID小鼠體內(nèi)產(chǎn)生胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。我們認(rèn)為bTS細(xì)胞具有滋養(yǎng)層干細(xì)胞的基本特征。此外，BTS-1細(xì)胞經(jīng)GFP慢病毒轉(zhuǎn)染并被DOX誘導(dǎo)后，14.81％的細(xì)胞能夠表達(dá)GFP。
　　3 bTS細(xì)胞系的基因表達(dá)寡聚核苷酸芯片分析和甲基化分析
　　在BTS-1中，有一些多潛能性基因表達(dá)水平低于其在囊胚中的表達(dá)水平，但高于它們?cè)贐FF中的表達(dá)水平，這一類基因

7、包括OCT4、SOX2、GDF3、KLF4、KLF5、SFRP2、SMAD3、SPARC、STAT3、TBX3和THAP11;在BTS-1細(xì)胞和囊胚中，TDGF、MYCN、CCR4、ALPL、SMAD2和SUZ12的表達(dá)水平相近，但它們?cè)贐TS-1的表達(dá)明顯高于BFF細(xì)胞;TFAP2A、ELF5、CYP11A1、PPARG、ID2、GCM1、HAND1和THAP11等TSC基因和TR基因在BTS-1細(xì)胞中表達(dá)很高;牛TR標(biāo)志物基因，例如

8、TDK和PAG，在BTS-1細(xì)胞中有很強(qiáng)的表達(dá)。對(duì)4種干細(xì)胞關(guān)鍵基因的甲基化分析結(jié)果顯示:與囊胚相比，BTS-1細(xì)胞中OCT4、NANOG和SOX2的甲基化程度分別升高168％(P＜0.001)、120％(P＜0.05）和116％(P＜0.001)。CDX2發(fā)生了甲基化，但2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與囊胚相比分別降低27％(P＜0.5)和57.7％(P＜0.001)。與BFF細(xì)胞相比，BTS-1細(xì)胞中NANOG和SOX2的甲基化程度分別上