牙鲆繁殖內(nèi)分泌分子機理研究.pdf

1、幾乎所有的養(yǎng)殖魚類都存在繁殖機能障礙。雌性魚類通常表現(xiàn)為卵母細胞不能最終成熟、排卵和產(chǎn)卵;雄魚表現(xiàn)為精液產(chǎn)量減少或者品質(zhì)較差。本論文主要以人工養(yǎng)殖的牙鲆(Paralichthys olivaceus)和野生的漠斑牙鲆(Paralichthyslethostigma)為研究對象,運用組織學、免疫組織化學、激素放射免疫測定方法及分子生物學方法,對牙鲆性腺、血漿性類固醇激素及6個與繁殖相關(guān)的基因進行研究,以期提供一些對于理解人工養(yǎng)殖的比目魚繁

2、殖機制和改善工廠化養(yǎng)殖魚類的繁殖調(diào)控有價值的參考信息,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.P450芳香化酶是細胞色素P450超家族的一員,由CYP19基因編碼;催化C19雄激素為芳香化的C18雌激素。為了解性腺型P450芳香化酶(CYP19α)在牙鲆繁殖過程中生理功能,采用RT-PCR方法檢測CYP19α mRNA在不同組織表達和精巢不同發(fā)育階段的表達。CYP19α mRNA大量表達在雌魚卵巢和脾臟,在雄魚精巢和脾臟CYP19α

3、 mRNA表達相對較弱,在其它組織沒有檢測到該基因表達。在雄魚繁殖周期,CYP19α mRNA表達水平變化與血漿中雌二醇的變化趨勢不一致。免疫組化研究表明:隨著精巢的發(fā)育,精原細胞、精母細胞對芳香化酶抗體的免疫陽性反應逐漸變?nèi)?精子細胞顯免疫陰性反應?？傮w看來,芳香化酶在精巢發(fā)育的早期有較強的表達。這些結(jié)果說明CYP19α參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生。
　　 2.細胞色素P450c17是單一的酶,在性腺和腎上腺類固醇激素合成過程中具有調(diào)解1

4、7α-羥化酶和17,20-裂解酶活性的作用。在硬骨魚類有二種類型的P450c17,P450c17-Ⅰ具有二種酶活性,P450c17-Ⅱ只有17α-羥化酶活性。在牙鲆克隆得到P450c17-Ⅰ和P450c17-Ⅱ的cDNA全長。RT-PCR分析表明P450c17-Ⅰ mRNA在心臟、精巢和卵巢表達豐富,P450c17-ⅡmRNA在腦、頭腎、腎、精巢和卵巢表達豐富。在精巢不同發(fā)育階段均檢測到P450c17-Ⅰ和P450c17-ⅡmRNA表達

5、,并且這二種基因的表達水平變化與血漿中睪酮水平和性腺指數(shù)變化趨勢基本相似。這些研究結(jié)果的生理學意義需要進一步實驗闡明。
　　 3.雌激素通過結(jié)合核受體蛋白,雌激素受體,在繁殖組織生長、分化和維持繁殖能力方面發(fā)揮重要作用。本研究通過PCR-SSCP方法檢測采集的雌性牙鲆雌激素受體β基因編碼區(qū)多態(tài)性,并對雌激素受體β基因的多態(tài)性與繁殖性能指標進行關(guān)聯(lián)分析。在雌激素受體β基因發(fā)現(xiàn)二個單核苷酸多態(tài)性位點:SNP1(c.577delC)和

6、SNP2[c.A891T(p.Gin114Leu)]。方差分析表明SNP1與雌性牙鲆性腺指數(shù)相關(guān)(P＜0.05),SNP2與雌性牙鲆的雌二醇水平和性腺指數(shù)相關(guān)(P＜0.05)。在SNP2位點,AB基因型個體比AA基因型個體具有較高的雌激素水平和性腺指數(shù)(P＜0.05)。本研究構(gòu)建4個二倍型;通過多重比較發(fā)現(xiàn)二倍型D2對肝重指數(shù)效應顯著高于其它二倍型(P＜0.05)。
　　 4.FOXL2基因具有參與卵巢發(fā)育,濾泡細胞分化和維持卵

7、巢生理功能的作用。本研究采用PCR-SSCP技術(shù)對采集的雌性牙鲆FOXL2基因進行多態(tài)性檢測,并對檢測到的遺傳多態(tài)性與其繁殖性能指標進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:引物3,引物4,和引物5的PCR產(chǎn)物具有多態(tài)性;共檢測到5個突變:SNP1[c.540A＞C(p.Asn102His)和c.591A＞G(p.Asn119Asp)],SNP2[c.864G＞A(p.Lys210Glu)和c.875G＞A1和SNP3(c.1169C＞A)。采用最小二乘

8、法對牙鲆的3個FOXL2基因突變位點和繁殖性能指標進行關(guān)聯(lián)分析:在Forkhead區(qū)域,SNP1對牙鲆性腺指數(shù)效應均達到顯著水平(P＜0.05)。在Forkhead區(qū)域下游,SNP2對牙鲆雌二醇效應達到顯著水平(P＜0.05)。在3'-非編碼區(qū),SNP3對牙鲆肝重指數(shù)效應達到顯著水平(P＜0.05)?；跈z測到的5個突變,構(gòu)建得到5種二倍型組合。通過多重比較,二倍型D3對睪酮水平效應和二倍型D5對性腺指數(shù)效應顯著高于其它二倍型(P＜0.

9、05)。
　　 5.近期在幾種硬骨魚類的研究表明膜孕酮受體alpha(mPRα)通過調(diào)節(jié)孕激素非基因組功能誘導卵母細胞成熟和精子運動。在當前研究通過分析mPRα在雄性牙鲆精巢不同發(fā)育階段mRNA表達進一步評價mPRα在配子和性腺的生理學作用。首先從牙鲆克隆得到mPRα的cDNA全長;預測的氨基酸序列與其它魚類mPRα的氨基酸序列高度同源如漠斑牙鲆(99％)、斑點犬牙石首魚(94％)和大西洋絨須石首魚(93％)。跨膜區(qū)域預測結(jié)果表

10、明牙鲆mPRα蛋白具有七次跨膜結(jié)構(gòu)。牙鲆mPRα mRNA廣泛表達在各檢測的組織,在腦、卵巢、精巢和腎臟表達豐富。牙鲆mPRα mRNA在精巢不同發(fā)育階段的表達變化趨勢與血漿雌二醇和性腺指數(shù)變化趨勢大體相似。所獲得數(shù)據(jù)支持我們的假設:mPRα是牙鲆成熟誘導類固醇受體。
　　 6.近來我們在牙鲆發(fā)現(xiàn)一個具有孕激素脂聯(lián)素受體特征的新基因PAQR-like基因,本研究報道新基因克隆和此基因部分特征。系統(tǒng)發(fā)生分析表明PAQR-like基

11、因位于PAQR7和PAQR8分支之間。預測的氨基酸序列與三刺魚未命名基因的氨基酸序列相似性為77％,與青鳉未命名基因的氨基酸序列相似性為72％。PAQR-like基因跨膜區(qū)域預測結(jié)果表明該基因具有7個跨膜區(qū)域,具有孕激素脂聯(lián)素受體特征。RT-PCR分析表明PAQR-like基因mRNA在卵巢、頭腎、精巢和腎臟表達豐富,在腦、鰓、腸、胃和幽門盲囊表達相對較弱。PAQR-like基因mRNA表達水平變化與性腺指數(shù)變化趨勢基本相似。這些特征表

12、明PAQR-like基因參與牙鲆繁殖生理活動。
　　 7.漠斑牙鲆是與牙鲆很相似的海洋硬骨魚類,其成熟誘導類固醇激素至今未見報道。當前研究目的是確定漠斑牙鲆卵母細胞成熟過程中產(chǎn)生的主要孕酮激素并調(diào)查在此過程中是否產(chǎn)生的主要孕酮激素分泌增加。完整的卵巢濾泡細胞經(jīng)氚標記的孕烯醇酮孵育,孵育后的產(chǎn)物經(jīng)薄層色譜方法確定。我們發(fā)現(xiàn)氚標記的孕烯醇酮通過生物化學方法主要轉(zhuǎn)變?yōu)?0β-S、17α,20β-DHP和11-脫氧皮質(zhì)醇。卵母細胞成熟過