荔枝EC長期繼代保持與體胚發(fā)生及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究以荔枝胚性愈傷組織(Embryogenic callus)、荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織(Transgenic resistant embryogenic callus)、荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體再生的胚性愈傷組織(Embryogenic callus derived from transgenic protoplasts,TPEC)細(xì)胞系為材料,將其長期繼代保持,并進(jìn)行荔枝體胚發(fā)生的同步化調(diào)控,在前人建立的高頻率體胚發(fā)生的技術(shù)體系上誘導(dǎo)

2、其體胚發(fā)生;通過RAPD和GUS檢測,進(jìn)一步研究荔枝不同類型細(xì)胞系的差異及GUS表達(dá)情況;以荔枝TPEC細(xì)胞系中的Q81.535為材料,研究其在添加和不添加ZT的條件下體胚發(fā)生過程的蛋白質(zhì)雙向電泳分析;并對荔枝體胚發(fā)生過程中相關(guān)蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定及其功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1荔枝不同類型細(xì)胞系胚性愈傷組織的長期繼代保持及差異
　　 荔枝EC、TREC和TPEC在前人繼代保持的基礎(chǔ)上,又將其延長保持了3年,并且

3、愈傷組織仍然呈淡黃色、生長旺盛、顆粒細(xì)小且松散,保持著很好的胚胎發(fā)生能力。并對部分荔枝TREC和TPEC不同細(xì)胞系的胚性愈傷組織進(jìn)行了GUS化學(xué)組織檢測,抗性細(xì)胞系Q811、Q81.535為大量穩(wěn)定表達(dá)GUS類型;Q9223為嵌合表達(dá)GUS類型;Q1016則為穩(wěn)定不表達(dá)GUS類型;TPEC不同細(xì)胞系中,Q811、Q81.535細(xì)胞系GUS為大量穩(wěn)定表達(dá)GUS類型,Q9223為嵌合表達(dá)GUS類型,Q1016則為穩(wěn)定地不表達(dá)GUS類型。比較

4、了荔枝不同類型細(xì)胞系在外觀(形態(tài)、色澤)和生長狀態(tài)上的差異,并對部分荔枝TREC和TPEC不同細(xì)胞系的胚性愈傷組織進(jìn)行了PAPD分析,其差異不是非常明顯。
　　 2荔枝體胚發(fā)生過程中總蛋白點數(shù)目變化
　　 使用線性IPG膠條(PH4-7)在Ettan IP GphorⅢ(GE Healthcare)進(jìn)行第一向等電聚焦,采用SE600 Rube標(biāo)準(zhǔn)垂直電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行第二向SDS-PAGE,銀染法

5、染色后凝膠采用Imagine ScannerⅢ(GE Healthcare)掃描儀采集圖像,在Image Master2D Platinum6.0軟件(GE Healthcare)上做圖像分析。結(jié)果表明:荔枝體胚發(fā)生過程中總蛋白點數(shù)目變化趨勢為先迅速上升,在MS20d升至最高點,后略有下降,再迅速下降,并且蛋白點數(shù)目在MS30d時降低至最低值,然后又經(jīng)歷一個迅速升高并保持穩(wěn)定的過程。體胚發(fā)生中期,即從ZT20d-ZT30 d其蛋白點數(shù)目

6、變化劇烈,經(jīng)歷了先迅速下降后迅速上升的過程。
　　 3荔枝體胚發(fā)生過程中總蛋白點等電點(pI)變化
　　 荔枝體胚發(fā)生過程中等電點在4-5范圍內(nèi)的蛋白點比例隨著不同培養(yǎng)時間和條件變化并不劇烈,蛋白點比例范圍幾乎都在10.00％-20.00％,其比例變化呈現(xiàn)先緩慢降低,后迅速升高,然后幾乎保持穩(wěn)定,再降低,迅速升高,最后迅速降低。pI值在5-6范圍內(nèi)的蛋白點比例變化呈現(xiàn)先緩慢降低,后迅速升高,再緩慢下降。pI值在6-7范圍

7、內(nèi)的蛋白點比例變化呈現(xiàn)先緩慢升高,在MS20d時達(dá)到最高,后迅速下降,然后幾乎保持穩(wěn)定,然后再緩慢下降,最后上升,總的變化趨勢類似“N”。
　　 4荔枝體胚發(fā)生過程中總蛋白點分子量(MW)變化
　　 在荔枝體胚發(fā)生過程中分子量(MW)30KD-45KD的蛋白點變化趨勢與分子量(MW)45KD-66KD的蛋白點變化趨勢基本一致,先迅速升高,后降低,再升高,再降低,最后上升。分子量(MW)20.1KD-30KD的蛋白點變化趨

8、勢呈現(xiàn)先快速上升,后略有下降,然后再上升,基本保持穩(wěn)定,變化不是非常明顯。分子量在14.4KD-20.1KD的蛋白點變化趨勢呈現(xiàn)先升高再降低,然后再升高,在MS40d時達(dá)到最大,后又快速下降。分子量在66KD-97KD范圍內(nèi)的大分子量蛋白點變化趨勢先升高,然后略有降低,然后基本保持不變。
　　 5荔枝體胚發(fā)生過程中15KD小分子量蛋白點數(shù)目變化
　　 在荔枝體胚發(fā)生過程中,小分子量蛋白數(shù)目基本呈先升高再大幅降低,后略有升

9、高,最后又大幅下降的趨勢,而小分子量蛋白點比例與小分子量蛋白數(shù)目變化趨勢不同,而是呈現(xiàn)先略有降低再大幅升高,后快速降低,然后大幅升高,最后又降低的趨勢,但是體胚發(fā)生在MS40d時期無論小分子量蛋白數(shù)目和比例都最高(10個,2.54％),小分子量蛋白在此時積累達(dá)到高峰。@6荔枝體胚發(fā)生過程相關(guān)蛋白表達(dá)變化
　　 在添加ZT培養(yǎng)基上荔枝正常體胚發(fā)生過程中,能量和碳代謝相關(guān)蛋白、細(xì)胞組成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)呈先降低再升高趨勢;脅迫

10、反應(yīng)/氧化還原相關(guān)蛋白、脂類代謝相關(guān)蛋白呈現(xiàn)逐步升高的趨勢;蛋白質(zhì)代謝與修復(fù)相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)呈升高再降低的狀態(tài);核酸代謝相關(guān)蛋白呈現(xiàn)先下降再上升,最后又下降的趨勢。
　　 在未添加ZT培養(yǎng)20 d時,能量和碳代謝相關(guān)蛋白、細(xì)胞組成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、核酸代謝相關(guān)蛋白、脂類代謝相關(guān)蛋白、蛋白代謝與修復(fù)相關(guān)蛋白有較強(qiáng)表達(dá),而在添加ZT培養(yǎng)20 d時則表達(dá)較低或不表達(dá);脅迫反應(yīng)/氧化還原相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白在

11、添加ZT培養(yǎng)20 d時表達(dá)比未添加ZT20 d時強(qiáng)。
　　 7荔枝體胚發(fā)生過程中相關(guān)蛋白的功能分析
　　 在荔枝體胚發(fā)生過程中,40個蛋白質(zhì)譜成功鑒定19個蛋白,再加上本實驗室李煥苓(2009)鑒定成功的10個蛋白,在這29個蛋白中,除20.69％功能未知的蛋白外,27.59％蛋白涉及脅迫應(yīng)答和氧化還原,24.14％蛋白和蛋白質(zhì)代謝與修復(fù)相關(guān),13.79％蛋白涉及能量和碳代謝,3.45％涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo),3.45％涉及核酸代