惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景及目的:
　　瘧原蟲屬于真球蟲目，血孢子蟲亞目，瘧原蟲科，寄生于人體可以引起人類瘧疾。尤其是惡性瘧原蟲，與75％的人類瘧疾有關(guān)[1]，瘧疾流行于102個國家和地區(qū)導(dǎo)致4億人感染，雖然大多數(shù)患者能夠治愈，可是仍有100萬人死亡，其中以兒童占了多數(shù)[2，3]。至今我國仍有約15個省（自治區(qū)）546個縣（市）近3億人口還在瘧疾威脅之中，南部惡性瘧病例增多，因此，瘧疾的防治在傳染性疾病中仍然居于重要地位[3]。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法

2、(ACT)是目前治療惡性瘧疾這一最致命的疾病形式最強有力的武器，其療效能達到90％以上[4，5]，但近年來科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)少數(shù)惡性瘧原蟲對青蒿素、氯喹等藥物表現(xiàn)出抗藥性，在部分東南亞地區(qū)日益嚴重在柬埔寨和泰國邊境地區(qū)近期已確認出現(xiàn)青蒿素耐藥性[6，7]，這為瘧疾的防治工作敲響了警鐘。開發(fā)抗瘧疾新藥不但至關(guān)重要而且面臨著急迫性。
　　寄生蟲體內(nèi)許多特殊的細胞器是寄生蟲特有的，是宿主體內(nèi)不存在的，通過對這些細胞器的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，就

3、有可能發(fā)現(xiàn)針對這些寄生蟲的特異靶標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)并命名的一個新細胞器—酸性鈣體(Ac)就是其中之一。酸性鈣體是一種特殊的細胞器，因其富含鈣和磷酸鹽，呈酸性，故命名為酸性鈣體[10-12]。隨后又在利什曼原蟲[13]、弓形蟲[14-17]、瘧原蟲[18-20]、艾美原蟲[21]、綠藻[22]、霉菌[23]、細菌[24,25]、卵黃[26-28]及人類血小板[29]中均發(fā)現(xiàn)有該類細胞器的存在。相對于大家所熟知的細胞器，這種新近發(fā)現(xiàn)的細胞器為

4、我們研究抗瘧新藥提供了更大可能性[30]。
　　研究發(fā)現(xiàn)，酸性鈣體的膜上有許多泵:如鈣泵(Ca2+-ATPase)、質(zhì)子泵(Vacuolar-H+-ATPase,Vacuolar-H+-pryopho sphatase)、鈉/氫泵(Na+/H+exchanger)、鈣/氫泵(Ca2+/H+ exchanger)和水蛋白通道(Aquaporin)、離子通道等[12]。其中，液泡型質(zhì)子焦磷酸酶為酸性鈣體所特有，已被應(yīng)用為酸性鈣體分離純

5、化及定位的標(biāo)志[31]。這些蛋白為酸性鈣體的主要生理功能奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。酸性鈣體的主要功能有4個:儲存磷酸鹽，儲存陽離子，調(diào)節(jié)pH值和調(diào)節(jié)滲透壓[32-36]。這些成分對寄生蟲的毒性、代謝和入侵宿主具有非常重要的作用。在對寄生蟲酸性鈣體的研究中，以錐蟲和弓形蟲的研究最為深入，瘧原蟲中也已證實有酸性鈣體的存在[18-20]，但對其研究遠不如錐蟲和弓形蟲深入，其具體的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能和代謝特點尚未十分清楚。為了找到更多可作為抗瘧新藥靶標(biāo)的蛋

6、白，我們需要對惡性瘧原蟲酸性鈣體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
　　方法與結(jié)果:
　　用傳統(tǒng)方法從惡性瘧原蟲中分離、純化酸性鈣體非常困難。因為惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)時，其生長過程受血清影響很大，很難標(biāo)準化，因此很難獲得足夠量的蟲體。本課題組在長期的惡性瘧原蟲相關(guān)研究過程中，建立了利用AlbuMAXⅠ替代人血清培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法，體外連續(xù)培養(yǎng)紅細胞感染率最高可以達到40％。該方法已證明能滿足大規(guī)模分離、純化蟲體的需求，可提供充足的蟲源。在

7、紅細胞感染率達到20％時，收集蟲血，經(jīng)60％的Percoll分離純化感染紅細胞后，用皂素室溫條件下溫和裂解紅細胞，得到純化的惡性瘧原蟲滋養(yǎng)體和裂殖體。細胞裂解液配合碳化硅碾磨裂解蟲體之后，收集勻漿上清。本實驗室在前期對伯氏瘧原蟲酸性鈣體進行研究時，摸索出適合分離純化伯氏瘧原蟲酸性鈣體的碘克沙醇密度梯度為15％、20％、25％、30％、34％和38％，相對離心力30000g。我們將相對離心力調(diào)整為50000g后，發(fā)現(xiàn)該梯度同樣適合惡性瘧原

8、蟲酸性鈣體的提取，離心管內(nèi)溶液分為13層，酸性鈣體被富集于最底層沉淀中。將最底層沉淀重懸后進行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的大小不等的圓形電子致密顆粒，對純化的惡性瘧原蟲感染紅細胞樣本經(jīng)制片處理后進行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)蟲體中有散在分布的大小不等空泡或包涵體。這些均與前人文獻報道相符，由此認為，本研究成功將惡性瘧原蟲酸性鈣體提取純化。
　　將純化的惡性瘧原蟲酸性鈣體樣品裂解、濃縮、電泳后，割膠進行液相色譜(LC-MS/MS)鑒定。

9、通過Mascot2.3.02軟件對鑒定得到的肽段進行分析比對，我們共得到283個鑒定蛋白質(zhì)，其中77個為假想蛋白質(zhì)，62個為惡性瘧原蟲保守蛋白，144個為已識別蛋白質(zhì)。對鑒定到的蛋白進行GO功能分析注釋，我們發(fā)現(xiàn)，在分子功能(Molecular Function)分類結(jié)果中，催化活性蛋白(catalyticactivity)和結(jié)合活性蛋白(binding activity)占絕大多數(shù)，分別為33.33％和55.56％;亞細胞定位(Cel

10、lular Component)結(jié)果顯示，16.67％的鑒定蛋白質(zhì)位于細胞器;參與生物進程(Biological Process)分類結(jié)果顯示，16.47％鑒定蛋白質(zhì)主要參與新陳代謝過程(metabolic process)、16.47％參與細胞過程(cellular process)、12.50％參與單一生物過程(single-organism process)。將鑒定到的蛋白質(zhì)和COG數(shù)據(jù)庫進行比對，預(yù)測這些蛋白質(zhì)大部分可能與能量生

11、產(chǎn)及轉(zhuǎn)換(Energproduction and conversion)、細胞內(nèi)交通、分泌及膜泡轉(zhuǎn)運(Intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport)和預(yù)測一般功能(General function predictiononly)有關(guān)。這些特征與酸性鈣體的四個主要功能相關(guān)。通過文獻檢索及生物學(xué)分析，最后初步預(yù)測液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)、磷酸核糖焦磷酸合成

12、酶、磷酸化型Ca2+ATP酶、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體蛋白、小GTP結(jié)合蛋白sar1、鈣依賴性蛋白激酶4(CDPK4)、14-3-3蛋白家族、水甘油通道蛋白(AQP)、液泡型質(zhì)子ATP酶、囊泡相關(guān)膜蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶、液泡型ATP合成酶等17個蛋白質(zhì)可能定位于惡性瘧原蟲酸性鈣體。本實驗室在對伯氏瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，初步預(yù)測了水通道蛋白、CCR4相關(guān)因子16、鈣依賴性蛋白激酶4(CDPK4)、多重耐藥蛋白(MRP)、液泡型ATP

13、合成酶亞單位(a，b，c，h，f)、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶、磷脂酰肌-3酶、磷脂酶A2(PLA2s)和液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)等18個蛋白定位于酸性鈣體。因伯氏瘧原蟲跟惡性瘧原蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組成、生理特點、生長周期等方面非常相似，因此，伯氏瘧原蟲酸性鈣體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于本實驗具有一定的指導(dǎo)意義。通過將惡性瘧原蟲酸性鈣體的17個預(yù)測蛋白和伯氏瘧原蟲酸性鈣體的18個預(yù)測蛋白進行對比分析，我們發(fā)現(xiàn)了8個蛋白在惡性瘧原蟲和伯氏瘧原

14、蟲酸性鈣體中均被預(yù)測有存在的可能。通過用ClustalW2對這8個蛋白進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其中有7個蛋白同源性較高，大于60％。
　　大量閱讀相關(guān)文獻并綜合以上分析后，我們選擇惡性瘧原蟲水甘油通道蛋白作進一步的研究，同時我們需要惡性瘧原蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶的抗體做共定位研究。因其二者跨膜區(qū)均較多，不易進行原核表達，多次嘗試均以失敗告終，故我們選擇利用合成肽與載體蛋白偶聯(lián)作抗原免疫小鼠的方法制備單克隆抗體。為了后續(xù)研究的開展，我們將

15、弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶的氨基酸序列與PfVP1作比對，選擇其同源序列合成肽段制備單抗，PfAQP單抗制備則選擇PfAQP與伯氏瘧原蟲水通道蛋白(PbAQP)的同源肽段進行合成。惡性瘧原蟲水通道蛋白(PfAQP)全長258個氨基酸，大小約為28kDa，弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(TgVP1)全長816個氨基酸，大小約為85kDa。針對PfAQP，經(jīng)過IEBD、BCPREDS Server1.0、TMHMM Server v2.0和同源性比

16、對分析，我們在PfAQP的6個跨膜區(qū)之外選擇了與惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲同源性較高的肽段，CPLVDLANNEKDGVDL，位于肽鏈全長的C端243～258個氨基酸。用這種方法我們最終獲得2C3和6H10兩株單抗，這兩株單抗不僅能與人工合成的多肽反應(yīng)，而且可以識別天然惡性瘧原蟲蛋白中的27kDa大小蛋白，與PfAQP預(yù)測大小及文獻報道相符[37]。而針對TgVP1，我們利用IEBD、TMHMM Server v2.0和同源性比對分析后，選

17、擇了其17個跨膜區(qū)外并與瘧原蟲同源性較高的肽段，用這種方法我們最終獲得單抗1D7-H11、3A6-E4和3G6-F9，這3株單抗均可以識別天然弓形蟲全蛋白中85kDa大小和惡性瘧原蟲全蛋白中76kDa大小蛋白。進行免疫熒光鑒定時，以上5株單抗均能產(chǎn)生特異性熒光，但PfAQP與TgVP1的熒光能否共定位仍需進一步驗證。
　　結(jié)論:
　　本研究建立了AlbuMAXⅠ替代人血清體外連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法，收集到足夠蟲體，成功分離