精子發(fā)生相關(guān)泛素化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、越來(lái)越多的夫婦會(huì)面臨不孕不育的困擾。解決這個(gè)問(wèn)題的基礎(chǔ)是在分子水平闡釋配子發(fā)生的分子機(jī)制，其中精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的細(xì)胞分裂和分化過(guò)程，從精原細(xì)胞的自我更新到正常精子的形成，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤都可能出現(xiàn)精子發(fā)生異常而導(dǎo)致不育。同其它蛋白質(zhì)修飾一樣，泛素化修飾對(duì)這一過(guò)程的調(diào)控是必不可少的。越來(lái)越多的證據(jù)表明各種泛素系統(tǒng)相關(guān)組分參與了精子發(fā)生的過(guò)程。本課題旨在利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸精子發(fā)生中一些重要的泛素化修飾蛋白和泛素化相關(guān)酶，

2、建立并優(yōu)化針對(duì)泛素化修飾特異的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和定量技術(shù)，有助于闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制，并為臨床相關(guān)疾病的診斷治療提供候選分子靶標(biāo)。
　　本研究首先利用非富集策略，對(duì)睪丸泛素化修飾蛋白與泛素化調(diào)控酶進(jìn)行鑒定。通過(guò)比較不同的二維分離鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)第一維使用HP-RP（高pH反相分離）技術(shù)分離效果優(yōu)于SCX（強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離），肽段在不同分離組分中的分布比較均勻;此外，質(zhì)譜產(chǎn)生的蛋白定性信息比較多，大大提高了蛋白質(zhì)的可信度。H

3、P-RP分離技術(shù)可以與第二維低pH反相分離正交，用于復(fù)雜樣品的大規(guī)模鑒定。利用這一技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建了小鼠睪丸蛋白表達(dá)譜系，單次實(shí)驗(yàn)得到8511種蛋白質(zhì)和88207種不同肽段。我們分析了小鼠睪丸蛋白譜系中泛素化蛋白鑒定情況，結(jié)果只鑒定到109個(gè)泛素化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于76個(gè)底物蛋白。但是鑒定了274種泛素化酶（E1、E2和E3）和59種去泛素化酶(DUBs)。大量泛素化修飾調(diào)控酶的表達(dá)說(shuō)明精子發(fā)生可能受到復(fù)雜的泛素化修飾調(diào)控。構(gòu)建了基于泛素化特征肽(

4、K-GG)富集策略的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，并成功應(yīng)用于小鼠睪丸精子發(fā)生中泛素化修飾蛋白的鑒定。與未經(jīng)富集的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相比，該富集策略可以大大提高泛素化肽段在質(zhì)譜儀器中的檢測(cè)效率。通過(guò)2次生物學(xué)重復(fù)，一共鑒定到13717個(gè)泛素化修飾位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于4200種底物蛋白。生物信息學(xué)分析提示這些泛素化修飾蛋白質(zhì)與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、DNA的損傷修復(fù)、免疫反應(yīng)、內(nèi)吞作用、細(xì)胞周期及凋亡等通路相關(guān)，該研究結(jié)果提示蛋白質(zhì)泛素化修飾

5、在精子發(fā)生的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為了尋找泛素化修飾定量方法，對(duì)蛋白組學(xué)定量技術(shù)進(jìn)行了研究，構(gòu)建了TMT（串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽）與18O定量技術(shù)平臺(tái)。利用TMT定量技術(shù)研究了精原干細(xì)胞(SSC)增殖、遷移與分化相關(guān)的蛋白表達(dá)差異，并用western驗(yàn)證了定量的準(zhǔn)確性。探討了18O定量技術(shù)的標(biāo)記效率、定量準(zhǔn)確性，并利用18O定量技術(shù)與泛素化富集相結(jié)合的策略進(jìn)行了泛素化修飾位點(diǎn)定量分析，為在睪丸中進(jìn)行泛素化修飾特異的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定