斜紋夜蛾抗真菌肽基因gallerimycin的克隆及功能研究.pdf

1、Gallerimycin基因是鱗翅目昆蟲中的一種抗真菌肽，它可以被多種細(xì)菌、真菌甚至金屬蛋白酶誘導(dǎo)，在脂肪體中合成，然后分泌到血淋巴中起作用。Gallerimycin主要對(duì)絲狀真菌有明顯活性，對(duì)細(xì)菌和酵母沒有抗性，在昆蟲體液免疫中起重要作用。
　　斜紋夜蛾是一種鱗翅目蔬菜害蟲，其幼蟲不僅食性雜，而且老熟幼蟲會(huì)形成暴食，對(duì)多種蔬菜都有危害。目前防治斜紋夜蛾幼蟲的主要化學(xué)方法仍然是使用化學(xué)農(nóng)藥。化學(xué)農(nóng)藥作為殺蟲劑的主要危害是污染環(huán)境；

2、容易使害蟲產(chǎn)生抗藥性；容易殘留在蔬菜上危害人類健康。隨著人們的環(huán)保意識(shí)的提高，以及對(duì)生活品質(zhì)要求的提高，化學(xué)殺蟲劑的危害逐漸顯現(xiàn)并引起人們的重視。因此萊氏野村菌等蟲生真菌的研究和生防應(yīng)用得到越來越多的關(guān)注。
　　本研究通過比對(duì)GenBank中g(shù)allerimycin的蛋白質(zhì)序列，找出gallerimycin氨基酸的保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，PCR擴(kuò)增其保守區(qū)序列；以gallerimycin基因的保守區(qū)序列作為依據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物，采

3、用3’RACE和5’RACE擴(kuò)增斜紋夜蛾老熟幼蟲gallerimycin基因的全長cDNA序列；在獲得gallerimycin基因全長cDNA的基礎(chǔ)上，通過表達(dá)譜分析和RNA干擾研究gallerimycin的基因功能。斜紋夜蛾老熟幼蟲gallerimycin基因的功能研究，有助于從分子水平上闡明斜紋夜蛾gallerimycin基因在體液免疫中的分子生物學(xué)機(jī)制，這對(duì)于研發(fā)新型生物殺蟲劑有重要的指導(dǎo)意義。
　　1.斜紋夜蛾galler

4、imycin基因的克隆
　　以被萊氏野村菌CQNr01侵染的斜紋夜蛾老熟幼蟲的cDNA作為模板，根據(jù)gallerimycin保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物，通過PCR獲得一個(gè)86bp的基因片段。通過NCBI BLAST進(jìn)行生物學(xué)信息分析，結(jié)果表明該片段的基因序列和草地貪夜蛾（Spdoptera frugiperda）有91％的相似性。在斜紋夜蛾gallerimycin基因保守區(qū)序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)基因特異性引物，用3’RACE和5’RACE

5、技術(shù)擴(kuò)增得到gallerimycin基因的全長cDNA序列，GenBank登錄號(hào)為HM747937?？寺〉玫降男奔y夜蛾gallerimycin基因cDNA序列長380bp，開放閱讀框長225bp，共編碼75個(gè)氨基酸，5’端和3’端非編碼區(qū)分別長22bp和133bp。該基因編碼的蛋白質(zhì)8.1KDa，等電點(diǎn)8.79，具有一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。進(jìn)化樹分析和氨基酸序列比對(duì)表明，該基因編碼的產(chǎn)物屬于gallerimycin。其一級(jí)結(jié)構(gòu)具

6、有g(shù)allerimycin的共同特點(diǎn)：具有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3個(gè)二硫鍵。
　　2.斜紋夜蛾gallerimycin基因的表達(dá)譜分析
　　通過RT-qPCR測(cè)定斜紋夜蛾老熟幼蟲被萊氏野村菌侵染后的不同時(shí)期，gallerimycin基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，gallerimycin基因的表達(dá)是和侵染時(shí)間成線性關(guān)系的。gallerimycin的表達(dá)量隨著侵染時(shí)間的推移逐步上升，到24小時(shí)達(dá)到最大值，隨后又逐步降低。
　　

7、3.gallerimycin基因的RNA干擾分析
　　根據(jù)gallerimycin基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)干擾引物，通過Ambion公司的MEGAscript High Yield Transcription Kit試劑盒獲得還有T7啟動(dòng)子的gallerimycin dsRNA。用微型注射器將dsRNA注射入斜紋夜蛾老熟幼蟲的腹腔。通過real-time PCR分析，干擾效率為73%，通過生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)gallerimycin基因被干擾的