馬鈴薯L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)即維生素C(Vitamin C，Vc)，是植物和大多數(shù)動物體內(nèi)合成的一類含量豐富的抗氧化劑和多種酶的輔因子，在生物體的生長發(fā)育過程中具有重要的代謝功能和調(diào)節(jié)作用。人類自身無法合成而又必需AsA，只能從膳食中獲得，因此，提高膳食中AsA含量對人類維持正常的生命活動至關(guān)重要。
　　 植物AsA 生物合成主要是通過半乳糖途徑，L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）是催化AsA合成最后

2、一步的關(guān)鍵酶。本研究從馬鈴薯葉片中克隆到編碼GLDH的基因StGLDH，構(gòu)建了GLDH的正、反義表達載體，轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，獲得轉(zhuǎn)正義、反義GLDH基因的馬鈴薯株系，研究了該基因在馬鈴薯葉片和塊莖中的表達水平、抗壞血酸含量及相關(guān)酶的活性；并研究了NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因試管苗和野生試管苗GLDH表達、抗壞血酸含量及抗壞血酸代謝系統(tǒng)部分酶活性的變化，初步明確了GLDH基因在馬鈴薯AsA代謝中的功能及超表達效果。主要結(jié)果如下：
　　

3、1.從馬鈴薯葉片中成功獲得了L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，GLDH，EC1.3.2.3)基因，命名為StGLDH，GeneBank注冊號為FJ755844。該基因全長2563 bp，其cDNA包含完整的開放閱讀框(551-2323)，編碼590個氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列分子量為67119 Da，等電點為8.5。在其5' 端具有一段推定的線粒體靶信號肽(put

4、ative mitochondrial)，其氨基酸序列的82FR/YA85 間存在該信號肽的切割位點(cleavage site)。StGLDH具有3個跨膜區(qū)(transmembrane region)，含有一個典型的黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域(FAD-binding region)和一個ALO結(jié)構(gòu)域。StGLDH編碼的氨基酸序列與番茄、辣椒、煙草同源性在90.6％-95.9％之間。
　　 2.將獲得的StGLDH基因與含有35S

5、啟動子的pBI 121載體重組，構(gòu)建真核表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化馬鈴薯。通過PCR、高濃度卡那霉素、熒光定量PCR等方法對帶卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株進一步檢測，證明獲得了4個轉(zhuǎn)正義、2個轉(zhuǎn)反義GLDH的馬鈴薯株系。
　　 3.GLDH的反義表達抑制了馬鈴薯株系anti-GLDH 13的生長和產(chǎn)量，使植株表觀發(fā)生了較大改變，表現(xiàn)出植株矮小，節(jié)間較短，葉片小、厚，表皮多毛，塊莖小，產(chǎn)量低，出芽早，抗性差等性狀。而GLDH的正義

6、表達對植株表觀影響較小，主要表現(xiàn)在使葉色變綠，部分株系（GLDH 155、GLDH 262）葉片偏圓，前期長勢較快等方面。
　　 4.兩個轉(zhuǎn)正義GLDH的株系GLDH 516、GLDH 518 GLDH超表達效果顯著，酶活性提高，AsA，DHA，AsA+DHA含量均相應(yīng)增加。GLDH 516、GLDH 518兩株系葉片AsA含量比野生型株系分別提高了47.16％、13.1％，塊莖中AsA含量分別提高了10.3％、6.8％；轉(zhuǎn)反義

7、基因株系anti-GLDH 13表現(xiàn)相反，葉片和塊莖中AsA含量分別比野生型株系減少了28.82％、10.3％。轉(zhuǎn)基因株系葉片中AsA水平變化幅度高于塊莖中AsA的變化幅度。
　　 5.用L-半乳糖內(nèi)酯飼喂馬鈴薯葉片，所有株系GLDH活性與AsA、DHA、AsA+DHA含量都大幅度提高。其中DHA、AsA+DHA含量，比飼喂前提高了約2倍，株系間AsA含量飼喂后差異減小。飼喂后，GLDH 516、GLDH 518株系A(chǔ)sA含量仍

8、保持最高，而anti-GLDH 13含量最低。
　　 6.0-250 mmol·L-1NaCl處理5天時，GLDH mRNA表達水平顯著提高，隨處理時間延長（15天），GLDH表達水平顯著降低。AsA含量、GLDH活性與GLDH表達變化趨勢一致，但遠不如GLDH變化幅度大。
　　 7.GLDH的正義表達提高了GLDH 516、GLDH 518兩個株系的耐鹽性，而反義表達降低了anti-GLDH 13株系的耐鹽性，各株系耐

9、鹽性與正常條件下試管苗AsA含量相關(guān)。250 mmol·L-1 NaCl脅迫5天后，所有株系A(chǔ)PX、MDHAR、DHAR活性升高，AO活性降低，MDA含量升高，AsA氧化加速。耐鹽株系脅迫后AsA含量的提高是AsA合成、再生加速共同作用的結(jié)果，而不耐鹽株系A(chǔ)sA含量的減少是因為AsA合成的減少和氧化的加速，而并非其再生限制造成的。不耐鹽株系膜脂過氧化較嚴重，anti-GLDH 13出現(xiàn)明顯脅迫癥狀。因此，GLDH表達水平和GLDH活性對