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文檔簡介
1、本實驗采用農(nóng)桿菌介導法將商陸抗病毒蛋白(Pokeweedantiviralprotein,pAp)基因導入煙草,用捕獲pBinARpap質粒的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404與煙草葉片外植體共培養(yǎng),并在附加30mg/LKan的MS+0.1mg/LIAA+1.5mg/LBA的培養(yǎng)基上誘導植株分化,生芽后在附加30mg/LKan+O.1mg/LNAA的MS培養(yǎng)基上生根,實現(xiàn)再生植株。經(jīng)過PCR檢測、PCR-Southern檢測、RT-PCR檢測
2、,綜合抗TMV病毒試驗結果,獲得能夠抵抗病毒侵染的工程植株.主要結果如下: 1.通過根癌農(nóng)桿菌葉盤轉化法,用含pBinARpap質粒的農(nóng)桿菌LBA4404侵染煙草K326,同時選擇了合適的Kan濃度對轉化過的外植體進行篩選,經(jīng)共培養(yǎng),選擇培養(yǎng),生根培養(yǎng),最終得到抗性植株,分化出苗,獲得了45株抗卡那霉索的煙草植株,并全部移栽成活。 2.提取抗性植株葉片的基因組DNA,用設計的引物對45株植株進行PCR檢測,結果只有一株檢
3、測到大小1000bp的目的片段。為證實擴增條帶為目的產(chǎn)物,進行PCR-Southern檢測,將PCR電泳凝膠轉移到尼龍膜上,然后用地高辛(DIG)標記的PAPDNA探針進行雜交分析,結果發(fā)現(xiàn)探針與陽性植株PCR擴增產(chǎn)物產(chǎn)生了強烈的雜交反應,進一步證實了PCR擴增片段的確為PAP基因,雜交結果證明PAP外源基因已整合進煙草細胞核基因組中。 3.Trizol法提取陽性植株的RNA,進行反轉錄PCR檢測,質粒DNA作為陽性對照,PCR
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