中國美利奴綿羊MHCClassⅡb區(qū)段349I12BAC克隆基因組成與結構分析.pdf

1、目的：用插有中國美利奴綿羊（新疆軍墾型）MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA的349I12 BAC克隆制備32P標記的放射性探針，進行噬菌體原位雜交篩選由中國美利奴綿羊（新疆軍墾型）外周免疫器官組織構建的cDNA文庫。旨在獲得349I12 BAC克隆內MHC片段的基因組成與結構信息，為后續(xù)中國美利奴綿羊MHC區(qū)段基因圖譜繪制、綿羊MHC區(qū)段內重要經(jīng)濟性狀相關基因研究和綿羊疾病抗性及易感性相關基因研究奠定基礎。
　　 方

2、法：首先，利用GENSCAN軟件對349I12 BAC克隆內插入MHC片段進行基因預測。其次，利用GeneQuest程序對349I12 BAC克隆內插入片段進行電子模擬酶切電泳，篩選合適的限制性內切酶，用于實驗中酶切349I12 BAC克隆質粒，制備32P標記的放射性探針。然后，將篩選出來的陽性單克隆送北京華大基因測序。最后，利用SeqMan和MegAlign程序對測序結果進行序列拼接和去重復，VecScreen軟件去載體，SIM4軟件

3、將其定位到349I12 BAC克隆內的MHC片段上。
　　 結果：1、GENSCAN軟件預測結果顯示349I12 BAC克隆插入片段中含有10個基因，其中斷裂基因9個；不完整基因1個；單外顯子基因2個。該結果可為后續(xù)實驗提供一個基因數(shù)目和結構上的參考。
　　 2、用限制性內切酶BsaJⅠ酶切349I12 BAC克隆內插入的中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA，然后用klenow酶對酶切片段進行末端

4、32P標記制備放射性探針。經(jīng)過多次噬菌體原位雜交篩選中國美利奴綿羊cDNA文庫后，獲得19個陽性單克隆。將篩選到的所有陽性單克隆送北京華大基因測序，測序結果經(jīng)整理后，最終得到17條不同的cDNA序列。
　　 3、利用SIM4軟件進行cDNA和genomic DNA間的序列剪接比對分析，結果顯示17條cDNA序列中有10條cDNA序列可以精確定位到349I12 BAC克隆內的中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic D

5、NA上。
　　 結論：本實驗通過噬菌體原位雜交篩選中國美利奴綿羊cDNA文庫，最終獲得17條不同的cDNA序列。這17條cDNA序列中有10條序列都能夠很好地定位到349I12 BAC克隆內中國美利奴綿羊MHC ClassⅡb區(qū)genomic DNA上，說明噬菌體原位雜交篩選cDNA文庫，是一種行之有效的、高效的表達序列分離方法。
　　 本實驗可為后續(xù)中國美利奴綿羊MHC區(qū)段基因圖譜的繪制奠定基礎；可為后期深入研究綿羊M