大熊貓基因組BAC文庫(kù)及Ⅱ類MHC基因組物理圖譜構(gòu)建.pdf

1、大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國(guó)特有的珍稀瀕危野生動(dòng)物。長(zhǎng)期以來(lái),棲息地片段化和種群數(shù)量下降,致使其野外僅分布于秦嶺、岷山、邛崍、大相嶺、小相嶺和涼山等6個(gè)相互隔離的山系,并分化為兩個(gè)獨(dú)立的亞種——秦嶺亞種和指名亞種。 為搶救性的保護(hù)大熊貓這一珍稀瀕危物種,我國(guó)政府于2003年啟動(dòng)了大熊貓的離體保護(hù)工程。該工程的主要內(nèi)容之一,就是通過(guò)建立大熊貓的基因組DNA文庫(kù),達(dá)到保護(hù)其遺傳資源,并為相關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)

2、研究提供基因材料平臺(tái)的目的。 本論文以細(xì)菌人工染色體(BAC)為載體,建立了高容量的大熊貓基因組DNA文庫(kù)。進(jìn)一步地,通過(guò)對(duì)大熊貓II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因組物理圖譜的構(gòu)建,既驗(yàn)證了該文庫(kù)的有效性,又對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了基礎(chǔ)研究的應(yīng)用,達(dá)到了立題目的。其主要研究結(jié)果如下： 1.以新鮮外周血為材料,利用pCC1BAC載體,成功構(gòu)建了大熊貓的基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)。文庫(kù)包含的205,800個(gè)BAC克隆,保存

3、于2,100塊96孔培養(yǎng)板上。經(jīng)對(duì)隨機(jī)挑取的174個(gè)BAC克隆進(jìn)行脈沖電泳檢測(cè),計(jì)算出文庫(kù)的平均插入片段為97kb,覆蓋大熊貓基因組約6.8倍(除去5.74％的空載體)。同時(shí),從文庫(kù)中獲得任一單拷貝或多拷貝大熊貓基因的概率為99.93％。 2.16對(duì)PCR引物平均每對(duì)能夠在文庫(kù)中成功擴(kuò)增到6.4個(gè)陽(yáng)性克隆,表明了所建文庫(kù)具有較高的覆蓋率。 3.運(yùn)用4D-PCR文庫(kù)篩選技術(shù),建立了大熊貓基因組BAC文庫(kù)的高效PCR篩選文庫(kù)

4、。該文庫(kù)包括43個(gè)超級(jí)庫(kù)和1462(43×34)個(gè)1D、2D、3D、4D超級(jí)亞庫(kù)。任一引物或探針只需77個(gè)PCR反應(yīng),即可從BAC文庫(kù)中篩選到所需的陽(yáng)性BAC克隆。 4.以大熊貓皮膚成纖維細(xì)胞為材料,運(yùn)用染色體熒光原位雜交(FISH)技術(shù),成功地將大熊貓的MHC II類基因組定位于第9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上。 5.通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列,設(shè)計(jì)了10對(duì)大熊貓MHC II類基因的特異性引物,并成功擴(kuò)增到了大熊貓Ⅱ類M