利用噬菌體展示技術篩選Cry2Ab毒素受體結合表位的研究.pdf

1、利用蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲基因發(fā)展的Bt作物已經(jīng)成為防治多種害蟲的新手段。轉Bt-Cry1Ae抗蟲棉花在我國通過有效控制棉鈴蟲的危害,可降低植棉成本和提高棉花的產(chǎn)量,但隨著Bt-Cry1Ac棉花的大面積推廣,棉鈴蟲的抗性風險不斷上升,嚴重威脅Bt棉花的持續(xù)利用。Cry2Ab毒素是新一代Bt棉花的主要殺蟲成分,已有研究證明棉鈴蟲對Cry2Ab與Cry1Ac毒素沒有交互抗性,因此可通過種植新

2、一代Bt棉花治理對Cry1Ac棉花的抗性。但到目前為止,國內外對Cry2Ab在棉鈴蟲中腸內的受體結合蛋白種類和受體結合表位等尚不清楚。鑒于Cry2Ab毒素與昆蟲中腸受體的結合是發(fā)揮作用的關鍵步驟,尋找棉鈴蟲中腸上皮細胞上的毒素結合蛋白和結合位點,對闡明Cry2Ab毒素作用機理,發(fā)展棉鈴蟲抗性治理技術有重要意義。本文應用噬菌體展示技術,對Cry2Ab毒素模擬表位進行了體外篩選,并驗證了模擬肽序列的生物學功能。
　　 Cry2Ab毒

3、素在活化并純化后,經(jīng)“吸附-洗脫-擴繁”的4輪生物淘選,并對陽性克隆所攜帶的外源DNA片段進行序列測定后,得到與活化Cry2Ab毒素具有高親和力的模擬肽序列NQFPSGAVYEHS和ATNEFPNPLHAP。將這兩段多肽與Cry2Ab毒素進行ELISA結合分析表明它們能與活化的Cry2Ab毒素進行特異性結合.通過Westearn-blot檢測發(fā)現(xiàn),加入的兩段多肽序列,可以抑制活化Cry2Ab與棉鈴蟲中腸BBMV的結合。將兩段模擬肽分別與

4、毒素孵育后,飼喂初孵棉鈴蟲可顯著降低Cry2Ab毒素對棉鈴蟲的致死和生長抑制作用。對活化Cry2Ab的Ligand-blot分析發(fā)現(xiàn),毒素在棉鈴蟲中腸BBMV上存在42kDa和100kDa兩個結合蛋白。
　　 上述實驗表明,篩選到的模擬肽序列具有明顯的生物學功能,其可能與Cry2Ab毒素在棉鈴蟲中腸內的受體結合位點具有相似的氨基酸序列或空間結構。Ligand-blot實驗證明Cry2Ab毒素主要存在兩種受體蛋白,其作用的發(fā)揮可能