上海地區(qū)致病性豬鏈球菌及其毒力基因的檢測.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原，根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同，分為35個血清型(1-34型，1/2型)。世界范圍內(nèi)以SS2(Streptococcus suis type 2)流行最廣，致病性最強，其次是1型、7型和9型。尤其是豬鏈球菌2型流行范圍最廣，對豬的致病性最強，而且可引起人的感染并致死。除SS2外,SS9主要在德國、比利時、西班牙、荷蘭等地流行；芬蘭以SS7最為流行。國內(nèi)199

2、1年在廣東省首次分離鑒定到SS2，隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)暴發(fā)人感染SS2并致人死亡，危害嚴重。不同血清型的地區(qū)分布不同。 上海地區(qū)是全國大規(guī)模豬養(yǎng)殖場較多的地區(qū)，是生豬輸出、輸入較大的城市，因此及時掌握上海地區(qū)致病性豬鏈球菌及其毒力因子的流行病學(xué)，為以后預(yù)防和控制大規(guī)模暴發(fā)豬鏈球菌具有重要的意義。 2005年-2007年期間，以上海市畜牧獸醫(yī)站日常豬病門診為基礎(chǔ)，部分規(guī)?；B(yǎng)殖場鼻拭子采樣

3、為輔，對上海地區(qū)主要致病性豬鏈球菌及其毒力因子進行流行病學(xué)調(diào)查。 首先對采的樣品中進行鏈球菌分離，根據(jù)培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色情況，分離鑒定了306株豬源鏈球菌，并對其進行藥敏實驗。根據(jù)豬鏈球菌16SrRNA和gdh(谷氨酸脫氫酶)基因設(shè)計合成引物，建立的二重PCR，結(jié)合乳膠凝集試驗對所分離的306豬源鏈球菌進行豬鏈球菌和鏈球菌A-G群鑒定，并對鑒定出的豬鏈球菌進行生化實驗。鑒定結(jié)果表明：門診分離的214株中，C群鏈球菌為主要致病菌

4、(87株，占40.7％)，豬鏈球菌次之(28株，占13.1％)，A群鏈球菌有4株，占1.9％；B群鏈球菌有16株，占7.4％；D群鏈球菌有18株，占8.4％；E群鏈球菌有14株，占6.5％；另外未能定型有47株，占22％。豬場鼻拭子分離的92株中，豬鏈球菌4株，占4.4％；D群鏈球菌有52株，占56.5％；另外未能定型有36株，占39.1％。 然后根據(jù)豬鏈球菌6種主要致病性血清型(1型、1/2型、2型、7型、9型和14型)菌株莢

5、膜多糖的編碼基因CPS1I，CPS2J，CPS7H，CPS9H的核酸序列的設(shè)計合清型分型。檢測結(jié)果表明：8株SS2(8/32)、3株SS1(3/32)、2株SS7(2/32)、2株SS9(2/32)，17株SS其它血清型。對SS1、SS2、SS7、SS9共15株菌株進行測序，測序結(jié)果與檢測結(jié)果符合率達100％，與GenBank發(fā)表的序列的同源性均在99％以上。根據(jù)豬鏈球菌7種主要毒力基因谷氨酸脫氫酶國(gdh)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(

6、gapdh)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)基因orf2，設(shè)計并合成7對引物，通過組合優(yōu)化設(shè)計，建立豬鏈球菌7種主要毒力因子的兩組多重PCR檢測方法，并對分離到的32株豬鏈球菌和12株實驗室豬鏈球菌保存菌株進行毒力基因檢測。結(jié)果表明：SS2大部分均具有7種毒力因子，SS1、SS7、SS9和其他血清型的豬鏈球菌也均具有部分毒力因子。32株豬鏈球菌中，mrp

7、檢出率為25％(8/32)、epf檢出率為21.9％(7/32)、sly檢出率為25％(8/32)、gdh檢出率為100％(32/32)，gapdh檢出率為100％(32/32)、orf2檢出率為78.3％(25/32)、fbps檢出率為25％(8/32)。15株上海分離株毒力因子的測序結(jié)果與GenBank發(fā)表的序列的同源性均在95％以上，12株實驗室保存菌株毒力因子的檢測結(jié)果與已知的背景材料一致。 為進一步研究所分離到的4種主

8、要致病性血清型菌株致病力，探討毒力基因和菌株致病力之間的關(guān)系，本實驗建立了斑馬魚(Danio rerio)和新西蘭白兔動物實驗?zāi)Ｐ停瑢嶒灲Y(jié)果表明：豬鏈球菌4種主要致病性血清型中，SS2對斑馬魚和新西蘭白兔均具有致病力，而SS1、SS7、SS9三種血清型對斑馬魚和新西蘭白兔致病力弱。因此上海地區(qū)分離的SS2菌株，不僅對豬有強致病性，對斑馬魚和新西蘭白兔也具有致病性，而SS1、SS7、SS9這3種血清型菌株對新西蘭白兔和斑馬魚致病性較弱，這