微流控LAMP芯片的研究及在生物分子床邊快速檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、本論文工作創(chuàng)造性地結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和微流控芯片技術(shù)，以特異保守基因分子標(biāo)簽為檢測(cè)對(duì)象，建立了單重、多重、定性、定量和集成LAMP微流控芯片，并成功應(yīng)用于豬偽狂犬病毒，甲型流感病毒和肺結(jié)核桿菌等重大傳染性病原體的快速診斷和分型。
　　 本論文工作利用同源分析軟件Vector NTI，借助美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank，搜尋得到豬偽狂犬病毒(DNA結(jié)合蛋白基因)，甲型流感病毒(紅細(xì)胞凝素酶編碼基因)和肺結(jié)核桿菌(GyrB蛋白編碼

2、基因)的特異性基因分子標(biāo)簽；利用PrimerExplorer V3軟件成功設(shè)計(jì)各分子標(biāo)簽的LAMP探針；通過(guò)單因素試驗(yàn)確立了最佳LAMP反應(yīng)體系；通過(guò)微機(jī)電加工技術(shù)和軟光刻技術(shù)制作各種LAMP微芯片模塊。
　　 1)單重定性/定量LAMP微芯片的反應(yīng)槽長(zhǎng)10 mm，寬0.6 mm，深0.8 mm，容納體積約5μL，利用PDMS材料的生物友好性、材質(zhì)氣密性和高透光性成功實(shí)現(xiàn)了LAMP擴(kuò)增和結(jié)果直接肉眼判定。通過(guò)整合穿透式微型光纖，

3、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片LAMP反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間點(diǎn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量目標(biāo)物含量。該芯片成功應(yīng)用于豬偽狂犬病毒的快速檢測(cè)，一次進(jìn)樣僅0.4μL，可在1小時(shí)內(nèi)高特異檢出10龜?shù)哪繕?biāo)物量，定量線性曲線的R2值達(dá)到0.9894。
　　 2)多重定性/定量LAMP微芯片具有多個(gè)發(fā)散式擴(kuò)增池，通過(guò)連接管道與擴(kuò)散限制毛細(xì)通道相連，中間為加樣孔，利用微小結(jié)構(gòu)通道中流體的低傳質(zhì)系數(shù)特性，杜絕了不同擴(kuò)增池中信號(hào)的混串，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)多重判定，通過(guò)整合反射式微

4、型光纖，準(zhǔn)確定量樣品中目標(biāo)核酸量。該芯片成功應(yīng)用于季節(jié)性流感病毒、豬源性流感病毒和普通甲型流感病毒的一步快速分型，進(jìn)樣僅4μL，可在45 mln至60 min內(nèi)高特異區(qū)分出被檢樣品中流感病毒的類型，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10個(gè)拷貝以下，定量線性曲線的相關(guān)系數(shù)R2值達(dá)到分別為0.9897、0.9962和0.9984。
　　 3)單重/多重集成LAMP微芯片由DNA提取室、LAMP擴(kuò)增室和螺絲微閥組成，利用PDMS材料的彈性特質(zhì)和螺絲微閥驅(qū)

5、動(dòng)和控制流體，成功地整合了核酸提取、擴(kuò)增和信號(hào)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了sample-to-answer的診斷效果。該芯片成功應(yīng)用于肺結(jié)核桿菌等細(xì)菌的快速診斷，僅需約10μL原始樣品量，可以在45 min至60 min內(nèi)通過(guò)肉眼快速判定樣品中是否含有肺結(jié)核桿菌或分型多種細(xì)菌性病原體。以上三種模式LAMP微芯片操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、樣品用量少、分析速度快且不依賴昂貴儀器，非常適合于床邊分子快速檢測(cè)和分析。該芯片體系可以擴(kuò)展到其它任意病原體的床邊快速檢測(cè)，