對(duì)蝦白斑癥病毒和魚類淋巴囊腫病毒檢測(cè)抗體芯片的制備與應(yīng)用.pdf

1、病毒性疾病嚴(yán)重威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展。鑒于目前病毒病尚無有效的治療方法,病毒的早期準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)疾病的預(yù)防和控制尤為重要,因此建立一種多樣品、多指標(biāo)檢驗(yàn)并行處理的簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的病毒檢測(cè)方法對(duì)病毒病的防控具有重要意義。新興的抗體芯片技術(shù)結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的特異性和芯片高密度集成優(yōu)勢(shì),只需少量生物樣品,一次檢測(cè)便可獲得幾種甚至幾萬種有關(guān)的生物信息或疾病的檢測(cè)結(jié)果,在人類疾病中病原/疾病標(biāo)志物等的檢測(cè)上已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但

2、尚未發(fā)現(xiàn)有利用抗體芯片法檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病毒的相關(guān)報(bào)道。本文將單克隆抗體(單抗)技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和抗體芯片技術(shù)相結(jié)合,以目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要病毒病的病原對(duì)蝦白斑癥病毒(White Spot SyndromeVirus,WSSV)和魚類淋巴囊腫病毒(Lymphoeystis Disease Virus,LCDV)為模式病毒,建立了水產(chǎn)動(dòng)物病毒檢測(cè)抗體芯片制備體系,優(yōu)選了芯片載體,優(yōu)化了反應(yīng)條件,研究了點(diǎn)樣緩沖液、抗體濃度、固定時(shí)間、封閉劑種

3、類和濃度、抗原.抗體反應(yīng)時(shí)間、不同標(biāo)記顯色方法等對(duì)芯片靈敏度的影響,制備了對(duì)蝦WSSV檢測(cè)抗體芯片和魚類LCDV檢測(cè)抗體芯片,并將其用于WSSV/LCDV的檢測(cè)。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.針對(duì)芯片載體的選擇和處理是制備高質(zhì)量抗體芯片的關(guān)鍵,本文制備了瓊脂糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、APES、醛基、巰基、多聚賴氨酸修飾玻片,綜合分析了以上6種不同修飾的玻片及氨基化玻片、硝酸纖維素(NC)膜、PVDF膜共9種不同載體對(duì)抗體的固定效率和

4、效果。結(jié)果顯示1.2％瓊脂糖凝膠修飾玻片表面信號(hào)點(diǎn)圓潤(rùn)、均勻,無邊緣擴(kuò)散和拖尾現(xiàn)象,信號(hào)值最高,而其他載體都有不同程度的拖尾現(xiàn)象,表明瓊脂糖凝膠修飾玻片對(duì)抗體的固定能力和固定效果最好。原子力顯微鏡顯示瓊脂糖凝膠修飾玻片表面為均勻的三維多孔結(jié)構(gòu),平均表面粗糙度為18.6 nm,結(jié)合瓊脂糖凝膠表面經(jīng)NaIO4活化后的醛基基團(tuán),能夠以物理吸附和共價(jià)結(jié)合的方式牢固的固定抗體。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取瓊脂糖凝膠修飾玻片作為抗體芯片的載體。
　　

5、2.以WSSV/LCDV病毒粒子為模式病毒,采用雙抗體夾心方式建立了水產(chǎn)動(dòng)物病毒的抗體芯片檢測(cè)體系。提純WSSV/LCDV病毒粒子,制備病毒的兔抗血清,純化后進(jìn)行特性分析。結(jié)果顯示純化后得到了高活性、高效價(jià)的兔抗WSSV及兔抗LCDV抗體,效價(jià)分別為1:64000和1:32000。
　　 復(fù)蘇本研究室前期制備的WSSV/LCDV單抗雜交瘤細(xì)胞株,采用腹水生產(chǎn)方法獲得大量WSSV/LCDV單抗,辛酸硫酸銨法結(jié)合Protein G親

6、和層析純化后進(jìn)行特性分析。結(jié)果顯示純化后WSSV/LCDV單抗效價(jià)均為1:32000,具很好的活性。采用Cy3抗體標(biāo)記試劑盒(GE)對(duì)純化后的高效價(jià)單抗作Cy3標(biāo)記,制備了特異性檢測(cè)WSSV/LCDV的抗體探針,Cy3標(biāo)記后WSSV/LCDV單抗探針的工作濃度分別為1:2400和1:3000。
　　 3.以制備的兔抗WSSV/LCDV多克隆抗體為捕獲抗體,用小型手動(dòng)芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)將其點(diǎn)樣于優(yōu)選的瓊脂糖凝膠修飾的芯片載體上,制備WS

7、SV/LCDV檢測(cè)抗體芯片。選用特異性強(qiáng)的Cy3標(biāo)記的WSSV/LCDV單抗為檢測(cè)抗體?？贵w芯片與WSSV/LCDV病毒稀釋液孵育形成復(fù)合物,該復(fù)合物被Cy3標(biāo)記的特異性WSSV/LCDV單抗探針識(shí)別,經(jīng)CCD芯片掃描儀讀取結(jié)果。通過改變芯片制備及應(yīng)用過程中的具體條件參數(shù),對(duì)點(diǎn)樣緩沖液、點(diǎn)樣抗體濃度、固定時(shí)間、封閉劑種類和濃度、洗滌方法、抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間、不同標(biāo)記顯色方法進(jìn)行了優(yōu)化,得到芯片制備與應(yīng)用的最佳條件。結(jié)果顯示,點(diǎn)樣用捕獲抗

8、體采用含50％甘油的PBS調(diào)整到合適濃度(兔抗WSSV抗體為0.1 mg/ml,兔抗LCDV抗體為0.5 mg/ml)進(jìn)行點(diǎn)樣,點(diǎn)樣后芯片于37℃飽和濕度固定2 h,3％牛血清白蛋白于37℃飽和濕度封閉1 h,依次用dH2O、PBST、PBST洗滌,每次5 min,甩干后低溫密封保存。芯片與捕獲抗體的反應(yīng)時(shí)間為15～30 min,檢測(cè)抗體與芯片上的抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)時(shí)間15～30 min,不要超過45 min。
　　 4.研究

9、了不同載體、不同標(biāo)記物(包括辣根過氧化物酶(HRP),Cy3,異硫氰酸熒光素(FITC),膠體金和生物素)標(biāo)記單抗用作檢測(cè)抗體、芯片保存時(shí)間等對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。結(jié)果顯示,以瓊脂糖修飾玻片作為載體制備的抗體芯片,分別采用HRP和Cy3標(biāo)記抗體探針作為檢測(cè)抗體,檢測(cè)靈敏度高,WSSV檢測(cè)抗體芯片的靈敏度分別為0.15μg/ml和0.31μg/ml,LCDV檢測(cè)抗體芯片的靈敏度均為0.55μg/ml。WSSV濃度在0.62μg/ml-9.9

10、μg/ml范圍內(nèi),熒光信號(hào)強(qiáng)度與病毒濃度的對(duì)數(shù)值與呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.98925;LCDV濃度在0.55-17.56μg/ml范圍內(nèi),信號(hào)強(qiáng)度與病毒濃度的對(duì)數(shù)值與呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9900。檢測(cè)信號(hào)經(jīng)生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)放大之后,靈敏度明顯提高,WSSV檢測(cè)抗體芯片可達(dá)25 ng/ml,LCDV檢測(cè)抗體芯片可達(dá)70 ng/ml。
　　 Cy3標(biāo)記抗體作為檢測(cè)抗體,抗體芯片于-20℃密封保存4個(gè)月后,檢測(cè)的背景值大

11、幅升高,從而導(dǎo)致相對(duì)信號(hào)值的下降。HRP標(biāo)記抗體作為檢測(cè)抗體,芯片于-20℃下密封保存12個(gè)月,WSSV檢測(cè)抗體芯片的檢測(cè)靈敏度不變;LCDV檢測(cè)抗體芯片靈敏度下降至1.1μ/ml。
　　 5.利用建立的抗體芯片技術(shù)平臺(tái),制備了WSSV檢測(cè)抗體芯片和LCDV檢測(cè)抗體芯片。將抗體芯片用于對(duì)蝦WSSV和魚類LCDV樣品的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosor-bent Assay,ELISA

12、)比較,結(jié)果顯示W(wǎng)SSV檢測(cè)抗體芯片與ELISA檢測(cè)的結(jié)果符合率為100％,相關(guān)系數(shù)為0.9853;LCDV檢測(cè)抗體芯片與ELISA檢測(cè)的結(jié)果符合率為100％,相關(guān)系數(shù)為0.9802。說明所制備的抗體芯片能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)病原,具有很好的特異性與準(zhǔn)確性。
　　 6.將抗體芯片技術(shù)與免疫酶技術(shù)結(jié)合,采用HRP標(biāo)記單抗探針作為檢測(cè)抗體,制備的WSSV/LCDV檢測(cè)抗體芯片用于對(duì)蝦WSSV與魚類LCDV的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),肉眼即可觀察檢測(cè)結(jié)果,解

13、決了抗體芯片結(jié)果的讀取依賴專用儀器的問題?？梢暬疻SSV/LCDV檢測(cè)抗體芯片用于病毒現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),操作簡(jiǎn)便,無需昂貴儀器,準(zhǔn)確性與IIFA法和ELISA法一致,信號(hào)值與病毒濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9505和0.9567,可在一定范圍內(nèi)對(duì)病毒進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè),在苗種選育、養(yǎng)殖生產(chǎn)的疾病監(jiān)測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本研究所建立的抗體芯片制備體系能夠拓展到其它水產(chǎn)動(dòng)物病原檢測(cè)領(lǐng)域,是對(duì)傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測(cè)手段的發(fā)展。構(gòu)建