家蠶P450基因CYP9A19和CYP9A22的啟動子分析.pdf

1、細(xì)胞色素P450酶系是一種廣泛存在于植物、動物、細(xì)菌和真菌體內(nèi)的一種解毒酶系，對藥物、致癌物、除草劑、殺蟲劑及其它環(huán)境有毒物質(zhì)的代謝過程中起到重要作用。家蠶既是鱗翅目昆蟲研究的模式生物，又是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的生物基礎(chǔ)，同時也是開發(fā)生物反應(yīng)器和新型昆蟲產(chǎn)業(yè)的材料。為深入了解家蠶細(xì)胞色素P450CYP9A19和CYP9A22兩個基因的誘導(dǎo)表達(dá)特征及其啟動子活性開展了研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 采用雙跟蹤標(biāo)定定量PCR方法，檢測了家蠶

2、CYP9A19和CYP9A22基因在無誘導(dǎo)及氟化鈉誘導(dǎo)下各個組織中的基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：CYP9A19在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達(dá)；CYP9A22在中腸、絲腺、馬氏管中有表達(dá)，但在脂肪體中無表達(dá)。氟化鈉誘導(dǎo)后隨時間變化的表達(dá)模式具有組織特異性，存在中腸、脂肪體先上調(diào)再恢復(fù)的正向誘導(dǎo)和馬氏管先下調(diào)再恢復(fù)的反向誘導(dǎo)兩種相反的誘導(dǎo)方向。結(jié)果說明：在家蠶P450基因中CYP9A19和CYP9A22與氟化物抗性的相關(guān)性密切

3、。
　　 同時在細(xì)胞水平上，利用RNA干擾手段通過轉(zhuǎn)染不同干擾位點片段的方法篩選出干擾效果顯著的siRNA片段。結(jié)果表明：Bm-9A19-663和Bm-9A22-1384分別使BmN細(xì)胞CYP9A19，CYP9A22基因表達(dá)降低到對照的49.5g％和48.00%，這兩個位點分別對兩種基因干擾顯著。當(dāng)干涉CYP9A19時，CYP9A22基因的表達(dá)水平無明顯差異；當(dāng)干涉CYP9A22時，CYP9A19基因的表達(dá)水平卻顯著上調(diào)。說明當(dāng)

4、CYP9A22基因表達(dá)明顯下調(diào)時，CYP9A19基因表達(dá)水平對其有一種補償效應(yīng)。
　　 家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的過量表達(dá)與外源環(huán)境有毒物質(zhì)的代謝有關(guān)。為了研究該兩個基因的表達(dá)調(diào)控機制，對其啟動子區(qū)域進行了功能分析，構(gòu)建了含熒光素酶報告基因和啟動子不同長度順次缺失片段的重組質(zhì)粒，和內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，瞬時表達(dá)后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。分析結(jié)果表明：家蠶CYP9A19基因啟動子轉(zhuǎn)

5、錄起始位點上游-1492～-1102bp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域；CYP9A22基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1630～-12lObp這一區(qū)域是重要的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。0.1×10-2mol/L、0.1×10-3mol/L、0.1×104mol/L的NaF誘導(dǎo)細(xì)胞后，其中在0.1×10-3mol/L的NaF條件下，熒光素酶活性增強顯著，表明0.1×10-3mol/LNaF能上調(diào)基因的表達(dá)。表明受氟化鈉誘導(dǎo)家蠶后CYP9A19和CYP9A2

6、2基因的上調(diào)表達(dá)與其基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的升高有一定的關(guān)系。本研究為探索家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理奠定了重要基礎(chǔ)，但其具體功能和作用機制還有待進一步研究。
　　 雙熒光素酶報告系統(tǒng)在啟動子活性方面研究應(yīng)用廣泛。我們就不同載體大小和構(gòu)建方法這兩個方面因素對雙熒光素酶系統(tǒng)的影響進行深入研究討論。結(jié)果表明，載體越大，轉(zhuǎn)染效率越低，并得到了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，提出了消除轉(zhuǎn)染效率差異誤差的標(biāo)準(zhǔn)化方法。另一方面，研究CYP