骨骼肌發(fā)育中miR-145a功能與qPCR內(nèi)參基因的研究.pdf

1、本文圍繞骨骼肌發(fā)育這一主題集中探討了兩個(gè)問(wèn)題：miR-148a在骨骼肌發(fā)育中的作用及其作用機(jī)理；不同發(fā)育時(shí)期豬骨骼肌基因表達(dá)分析技術(shù)qPCR中內(nèi)參基因的選擇。主要工作及結(jié)果如下：
　　 1.骨骼肌發(fā)育中miR-148a的功能研究
　　 MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA。這類(lèi)小RNA通過(guò)降解靶基因mRNA或者阻滯蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控基因的表達(dá)。它們?cè)谠缙诎l(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生物學(xué)

2、過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　 在前期應(yīng)用深度測(cè)序技術(shù)(Deep Sequencing Approach)篩選出一系列在豬的胚胎和成年骨骼肌不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的miRNAs的研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)miR-148a在胚胎時(shí)期的骨骼肌組織中高表達(dá)，但在成年豬的骨骼肌中幾乎不表達(dá)。目前已經(jīng)報(bào)道m(xù)iR-148a與癌癥相關(guān)，但它在骨骼肌發(fā)育中的功能迄今還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 在本研究中，我們從多個(gè)方面探討了miR-148a在骨骼肌

3、發(fā)育中的功能。我們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)miR-148a能促進(jìn)成肌細(xì)胞分化并一定程度阻滯細(xì)胞周期，以及miR-148a是通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路中ROCK1的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉分化的正向調(diào)控。
　　 (1)我們首先建立了C2C12細(xì)胞體外分化模型，通過(guò)對(duì)miR-148a在分化第0天、1天、3天和5天表達(dá)的定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-148a隨著C2C12分化上調(diào)表達(dá)。
　　 (2)通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)miR-148a后的C2C12細(xì)胞

4、進(jìn)行全基因組表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-148a過(guò)表達(dá)促進(jìn)了一系列肌肉特異性基因的上調(diào)，并利用qPCR檢測(cè)了6個(gè)上調(diào)表達(dá)的肌特異性基因(Tnnt3、Mb、Mylpy、Myom3、myogenin和IGF2)的表達(dá)，驗(yàn)證了芯片檢測(cè)結(jié)果。
　　 (3)誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)或抑制miR-148a后C2C12和骨骼肌原代細(xì)胞分化，并檢測(cè)分化標(biāo)志基因MHC、myogenin和Skeletalα-actin在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)變化。結(jié)果表明：

5、過(guò)表達(dá)miR-148a后分化標(biāo)志基因上調(diào)，反之抑制miR-148a后分化標(biāo)志基因下調(diào)，因此證明miR-148a能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，具有正向調(diào)控肌肉分化的功能。
　　 (4)應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)方法分析miR-148a對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)或抑制miR-148a對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析miR-148a對(duì)C2C12細(xì)胞周期的影響，在C2C12中過(guò)表達(dá)miR-148a，發(fā)現(xiàn)miR-148a實(shí)驗(yàn)

6、組中處于G1期的細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而處于S期的細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明miR-148a加強(qiáng)了G0/G1期的細(xì)胞阻滯，有利于肌細(xì)胞分化。
　　 (5)在探明miR-148a促進(jìn)成肌細(xì)胞分化后，我們應(yīng)用TargetScan和miRanda軟件對(duì)miR-148a的靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出候選靶標(biāo)ROCK1基因(一種分化抑制基因)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定了ROCK1的3'UTR(非翻譯區(qū))含有miR-1

7、48a的作用靶位點(diǎn)，同時(shí)運(yùn)用qPCR和western blot驗(yàn)證了miR-148a抑制ROCK1的蛋白翻譯，而不影響其轉(zhuǎn)錄。
　　 (6)運(yùn)用siRNA干擾C2C12和骨骼肌原代細(xì)胞內(nèi)源性ROCK1后，其表達(dá)受到抑制，而分化標(biāo)志基因的表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果說(shuō)明ROCK1是分化抑制基因，而且干擾ROCK1表達(dá)可促進(jìn)肌細(xì)胞分化。
　　 2.骨骼肌基因表達(dá)分析qPCR中內(nèi)參基因的選擇
　　 在基因表達(dá)分析，如定量PCR(

8、quantitative polymerase chain reaction，qPCR)中，通常用內(nèi)參基因(reference gene)來(lái)校正目標(biāo)基因的表達(dá)量。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種實(shí)驗(yàn)因素條件下都恒定表達(dá)。但大量的研究結(jié)果證明，在不同組織、不同發(fā)育階段和不同實(shí)驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)都存在不同程度的變化。因此，在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析qPCR中，選擇合適的內(nèi)參基因用于目標(biāo)基因表達(dá)量的校正，是得到準(zhǔn)確可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。
　　 本研究主

9、要探討了豬不同組織和不同發(fā)育時(shí)期骨骼肌基因表達(dá)qPCR分析中內(nèi)參基因的選擇。我們首先應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)6個(gè)候選內(nèi)參基因(GAPDH、ACTB、H3F3A、HPRT1、RPL32和RPS18)，在通城豬和長(zhǎng)白豬不同組織和不同胚胎時(shí)期骨骼肌(胚胎期第33天、65天和90天)中的表達(dá)量。通過(guò)運(yùn)用NormFinder、BestKeeper和geNorm三種軟件評(píng)價(jià)這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。我們的結(jié)果表明，這6個(gè)候選基因在不同豬種、不同組織

10、和不同發(fā)育階段的骨骼肌中都存在表達(dá)的不穩(wěn)定性，但其中表達(dá)較為穩(wěn)定的基因是RPS18、PRL32和H3F3A。
　　 本研究同時(shí)探討了以上3個(gè)內(nèi)參基因的組合。結(jié)果表明：在通城豬骨骼肌不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析中，H3F3A和RPS18是最合適的內(nèi)參基因組合；在長(zhǎng)白豬骨骼肌不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析中，PRL32和RPS18是最合適的內(nèi)參基因組合；在通城豬和長(zhǎng)白豬的不同組織中，PRL32和RPS18表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，再聯(lián)合H3F3A一起