煙草花葉病毒納米顆粒粒度調控及其殼蛋白的表面修飾.pdf

1、煙草花葉病毒(TMV)作為一種模式病毒，人們對它的研究已經(jīng)有一百五十多年的歷史了，這是一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有極大危害的植物病毒病原體，同時也是植物病毒中研究得最為詳細的一種，在形態(tài)、結構、化學組成、組裝、外殼、亞基組成、基因組結構、核酸復制、蛋白翻譯、病毒在細胞間的運動等方面常作為病毒學研究的經(jīng)典范例，幾乎所有關于病毒的研究都是從煙草花葉病毒起步的。
　　 近年來，對于煙草花葉病毒的研究已經(jīng)開始從植物病毒學、抗病毒試劑等范疇，逐漸轉移

2、到生物納米材料領域開始探索其在工業(yè)和醫(yī)學領域的應用潛力。天然的煙草花葉病毒本身位于納米尺度，擁有良好的空間排列結構，可以作為無機氧化物、金屬附著的模板指導功能納米材料的合成。病毒內外表面殼蛋白上的氨基酸可以被修飾，使病毒帶有諸如導電性，聚合性等成為電導線或者更長的聚合物，或者使某些功能基團在病毒表面均勻分布，使其成為新的探針或者生物納米材料。另外，隨著基因治療的興起，具有侵染宿主細胞功能的病毒成為了天然的基因藥物載體，它們可以將具有治療

3、價值的基因導入靶細胞并使其發(fā)揮有效性，以達到治療疾病的目的。煙草花葉病毒組裝只需要起始組裝位點，對延伸RNA片段的長短和序列并不敏感的特征，使它成為攜帶外源基因載體的候選人。
　　 本文的工作主要包括兩個方面：
　　 一、煙草花葉病毒本身有著極其規(guī)律的螺旋堆積方式和簡單而規(guī)律的組裝特性，它的組裝只需要RNA上起始組裝位點和20S殼蛋白的相互識別，延伸過程中對RNA的序列和長度并無苛刻要求，這是本文中對病毒顆粒的長度進行調

4、控的理論基礎。野生型煙草花葉病毒長度固定在300nm，這極大限制了它的可利用范圍，我們希望在體外通過控制參與組裝的RNA的長度從而控制病毒顆粒的長度，得到期望長度的顆粒。我們使用PCR擴增出不同目的長度的DNA分子用于體外轉錄的模板以得到相應的包含起始組裝位點的RNA片度，進一步與殼蛋白在一定條件下組裝得到長度均一的納米顆粒，從而實現(xiàn)了對顆粒長度的調控，并且可以構建出全長300nm范圍內任意長度的納米顆粒。
　　 二、在殼蛋白的

5、修飾方面，化學修飾方法總是很難實現(xiàn)精確定位對病毒進行改造，基因層面的修飾也都是對病毒整體而言進行的。在本文中我們在實驗室高爽博士的工作基礎上對在體外構建的野生型的殼蛋白進行了定點突變。通過對已經(jīng)報道的不同種屬的煙草花葉病毒殼蛋白進行多序列比對，選擇出了4個位于病毒顆粒外表面的非保守位點的氨基酸殘基D64、R141、V151和T153，它們均被突變?yōu)镃ys。與以往文獻報道直接在C末端增加一個Cys不同的是，多序列比對的方法選擇出的非保守殘