灰飛虱對(duì)氟蟲腈的抗性機(jī)制研究.pdf

1、灰飛虱Laodelphax striatellus(Fall(')en)屬半翅目、飛虱科，主要分布于從菲律賓至西伯利亞一帶的亞洲稻區(qū)和歐洲的溫帶地區(qū)。近年來(lái)，灰飛虱在江蘇、浙江、上海、安徽及山東等地發(fā)生嚴(yán)重，造成病毒病流行，給水稻的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響。目前，化學(xué)防治仍然是控制灰飛虱的主要措施。為了控制害蟲，新煙堿類和苯基吡唑類殺蟲劑，例如:吡蟲啉和氟蟲腈，曾被廣泛用于防治稻飛虱。由于頻繁的使用氟蟲腈，導(dǎo)致在東亞和東南亞地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了

2、抗性問(wèn)題。氟蟲腈作為苯基吡唑類的第一個(gè)新型殺蟲劑，目前對(duì)于它的作用機(jī)制尚不十分明確，因此，很有必要進(jìn)行氟蟲腈的靶標(biāo)抗性機(jī)制、生化機(jī)制及其交互抗性研究。本研究結(jié)果可為科學(xué)合理使用同類藥劑提供理論依據(jù)，同時(shí)可以豐富殺蟲劑毒理學(xué)理論知識(shí)，為抗藥性的治理提供理論依據(jù)。
　　 本文在抗性篩選的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了灰飛虱對(duì)氟蟲腈的抗性靶標(biāo)機(jī)制研究、生化機(jī)制及交互抗性研究，旨在明確灰飛虱對(duì)氟蟲腈的抗性機(jī)制。
　　 1.灰飛虱谷氨酸門控氯離子

3、通道(GluCl)基因的克隆與序列分析
　　 采用簡(jiǎn)并引物和半巢式PCR技術(shù)從灰飛虱中克隆谷氨酸門控氯離子通道(GluCl)受體基因，獲得了1個(gè)長(zhǎng)度為431bp的目標(biāo)基因中間片段，根據(jù)這個(gè)中間片段設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增，成功地獲得了灰飛虱GluCl亞基的全長(zhǎng)基因序列。其基因GenBank登錄號(hào)為:JF430868。該基因cDNA全長(zhǎng)為2112bp，開放閱讀框(ORF)為1359bp，ORF編碼452個(gè)氨基酸殘基。其蛋白質(zhì)分

4、子量為52.12560KDa，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為8.3。GluCl與已報(bào)道的其他昆蟲的GluCl基因氨基酸序列比對(duì)，一致性為79％-86％。
　　 2.灰飛虱谷氨酸門控氯離子通道(GluCl)基因的多態(tài)性研究與突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)
　　 為了尋找灰飛虱對(duì)氟蟲腈產(chǎn)生抗性的靶標(biāo)基因的突變位點(diǎn)，本研究利用巢式PCR技術(shù)分別從原始品系和抗性品系中克隆了20頭和10頭灰飛虱成蟲的單個(gè)個(gè)體的谷氨酸門控氯離子通道(GluCl)基因的開放閱讀框序列

5、，對(duì)所獲得的目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，共有75個(gè)位點(diǎn)的堿基變化造成了氨基酸的替換。在這75個(gè)氨基酸替換中，9個(gè)(L13P、D63A、P65H、A66T、V67I、V74L、S76P、V83T、T84K)分別為抗性和敏感品系的部分個(gè)體所具有，31個(gè)(T7A、I19T、N23D、T33H、P104S、P128L、E132G、H136R、I149V、L176P、D194V、P197S、E201G、G201R、V205E、C237R、

6、L242E、Y250H、V263M、S275G、P278S、M291T、N299D、L302P、Y309R、E328G、Q344R、E353G、N373S、K389R、K394R)僅發(fā)生在部分抗性品系中。剩下的35個(gè)(S27P、Q43R、G46D、S48C、I72L、I77T、K79T、D81S、D82N、V83I、W97R、L102P、T146C、I161V、C167R、D194G、Y250C、Y256C、S282P、V285A、L2

7、88P、S306P、T315A、M345V、M345T、Q351R、C352Y、V395A、C406R、T415P、R417H、I426T、P428Y、L437P、R446Q)僅發(fā)生在部分原始品系中。2個(gè)（V83T和V83I，M345V和M345T）在原始品系中的同一個(gè)氨基酸位置發(fā)生了不同的氨基酸替換。2個(gè)（D194V和D194G，Y250H和Y250C）在同一個(gè)氨基酸位置分別在抗性和原始品系中發(fā)生了不同的氨基酸替換。P278S存在于第

8、二跨膜區(qū)，與之前已報(bào)道的其他物種的P299S是同一跨膜區(qū)的相似突變位點(diǎn)，而P299S是普遍存在于第二跨膜區(qū)的突變位點(diǎn)，因此，P278S氨基酸突變可能與氟蟲腈的抗性有關(guān)。
　　 3.灰飛虱GABA受體基因的克隆與突變位點(diǎn)分析
　　 為了尋找灰飛虱對(duì)氟蟲腈產(chǎn)生抗性的靶標(biāo)基因的突變位點(diǎn)，本試驗(yàn)采用巢式PCR技術(shù)分別從抗性品系和原始品系中克隆了23個(gè)和20個(gè)單頭灰飛虱成蟲的GABA受體基因。并通過(guò)基因序列比對(duì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，

9、在原始品系和抗性品系中均沒有發(fā)現(xiàn)保守的突變位點(diǎn)A302S，但是在同一位置，在原始品系中只有一種基因型(Ls-Ala)，而在抗性品系中不僅有基因型(Ala)，還有另一種基因型(Asn)，即該位置的氨基酸由丙氨酸替換成了天冬酰胺氨基酸。而且該突變基因的頻率在抗性種群中達(dá)到80％。本研究進(jìn)一步證實(shí)了灰飛虱Γ-GABA受體基因的A2'N點(diǎn)突變位點(diǎn)可能與氟蟲腈的抗性有關(guān)。除此之外，在含有A2'N突變的個(gè)體中同時(shí)存在R305Q或R305W點(diǎn)突變，該

10、突變可能也與氟蟲腈的抗性有關(guān)。
　　 4.灰飛虱對(duì)氟蟲腈的抗性生化機(jī)制研究
　　 為了了解灰飛虱對(duì)氟蟲腈產(chǎn)生高水平抗性是否代謝抗性有關(guān)，在室內(nèi)測(cè)定了四種增效劑順丁烯二酸二乙酯(DEM)、磷酸三苯酯(TPP)、氧化胡椒基丁醚(PBO)及脫葉磷(DEF)在原始和抗性品系中對(duì)氟蟲腈的增效作用，結(jié)果表明:四種增效劑在原始品系（SR分別為0.77、0、89、0.91和0.93）和抗性品系（SR分別為1.27、1.18、1.18和1

11、.00）中均沒有增效作用。進(jìn)一步對(duì)原始和抗性品系的三種解毒酶的離體活性測(cè)定發(fā)現(xiàn):灰飛虱抗性品系的多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與原始品系的比活力分別為:0.90倍、0.99倍和0.99倍。結(jié)果表明多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶不是引起灰飛虱對(duì)氟蟲腈產(chǎn)生高水平抗性的主要因素。
　　 5.抗氟蟲腈灰飛虱的交互抗性研究
　　 本研究通過(guò)測(cè)定氟蟲腈與狄氏劑和硫丹在抗性品系和原始品系中的交互抗性水平進(jìn)一步驗(yàn)證了