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1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種世界性分布的病原真菌,能導(dǎo)致多種重要作物的病害。盾殼霉(Coniothyrium minitans)是防治菌核病的一種重要生防菌。盾殼霉分生孢子的形成對(duì)其完成自身的生活史及重寄生作用非常重要。關(guān)于盾殼霉的產(chǎn)孢機(jī)理已有一些報(bào)道,但盾殼霉產(chǎn)孢是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,分生孢子形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前尚不清晰。本論文主要以自盾殼霉T-DNA插入體庫(kù)中篩選到的一株產(chǎn)
2、孢缺陷型突變體ZS-1T1000為研究對(duì)象,通過(guò)TAIL-PCR等技術(shù)獲得了T-DNA的側(cè)翼序列,并以此展開研究了盾殼霉中與細(xì)胞壁完整性相關(guān)的MAPK途徑(CWI-MAPK)在盾殼霉重寄生、產(chǎn)孢及其維系自身細(xì)胞壁穩(wěn)定過(guò)程中的作用。同時(shí)也研究了與酵母中的另一MAPK途徑,F(xiàn)US3/KSS1 MAPK途徑中STE7的同源物CmSTE7在盾殼霉寄生核盤菌菌核中的作用,主要研究結(jié)果如下:
1)突變體ZS-1T1000喪失產(chǎn)孢能力系
3、由T-DNA單拷貝插入破壞所致,T-DNA插入破壞了一個(gè)編碼蛋白激酶激酶激酶的CmBCK1基因。CmBCK1基因的3’臨近末端處含有一個(gè)內(nèi)含子,基因編碼區(qū)序列(CDS,coding sequence)為5361 bp,編碼大小為1786 aa的蛋白質(zhì)。T-DNA插入在該基因的5100 bp位點(diǎn),破壞了該蛋白質(zhì)的蛋白激酶催化保守結(jié)構(gòu)域。CmBCK1基因在盾殼霉基因組中為單拷貝基因,T-DNA的插入導(dǎo)致CmBCK1功能缺失,致使ZS-1T1
4、000不能形成分生孢子器及分生孢子,寄生菌核能力顯著下降,對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑及細(xì)胞壁降解酶敏感,菌落中央氣生菌絲發(fā)生自溶,產(chǎn)色素能力顯著下降。
2)CmBCK1基因敲除轉(zhuǎn)化子喪失產(chǎn)孢能力,中央的氣生菌絲出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,產(chǎn)色素能力顯著下降,對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑及細(xì)胞壁降解酶敏感,在寄生菌核能力方面存在缺陷,寄生能力顯著下降,其表型與突變體ZS-1T1000類似。
3)根據(jù)序列同源性,自盾殼霉中克隆了酵母CWI-MA
5、PK途徑中BCK1下游Slt2的同源基因CmSlt2。CmSlt2基因含有5個(gè)內(nèi)含子,CDS為1254 bp,編碼大小為417aa的蛋白質(zhì)。與CmBCK1突變體類似,CmSlt2基因的敲除轉(zhuǎn)化子也喪失了產(chǎn)孢能力,寄生核盤菌菌核能力顯著下降,增加對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑及細(xì)胞壁降解酶的敏感性,影響色素的形成,菌落中央菌絲自溶。CmSlt2突變體的缺陷表型可被自身的CmSlt2基因互補(bǔ)所恢復(fù)。
4)結(jié)合CmBCK1及CmSlt2在盾
6、殼霉中功能,表明CWI-MAPK途徑參與調(diào)控盾殼霉的產(chǎn)孢、重寄生作用、色素形成及維持細(xì)胞壁穩(wěn)定。
5)從盾殼霉中克隆了與酵母FUS3/KSS1 MAPK途徑中STE7同源的CmSTE7。CmSTE7基因含有3個(gè)內(nèi)含子,CDS為1362 bp,編碼大小為453 aa的蛋白質(zhì)。CmSTE7突變體菌落白色,不產(chǎn)生色素(后期在培養(yǎng)基基質(zhì)中產(chǎn)生微量的色素),不能形成分生孢子器,氣生菌絲增多,菌絲頂端分支增多,對(duì)核盤菌菌核的重寄生能力
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