家蠶四氫生物蝶呤合成相關(guān)酶基因的克隆表達與酶活性分析.pdf

1、芳香族氨基酸羥化酶及一氧化氮合酶在神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)皮功能中有著重要的作用。四氫生物蝶呤(BH4)作為這些酶的重要輔助因子，其合成或再生障礙會導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏以及細胞內(nèi)皮功能障礙。臨床醫(yī)學(xué)上把口服BH4作為治療某些疾病的有效方法。然而通過化學(xué)方法合成BH4比較困難，以致經(jīng)化工合成的BH4價格非常昂貴。墨蝶呤(SP)是一種昆蟲內(nèi)源性色素，大量沉積于黃體色家蠶突變體(lem)的幼蟲體表。SP是經(jīng)補救途徑合成BH4的前體。為了開發(fā)高效低耗、程序簡

2、單、產(chǎn)量可觀的BH4體外合成工藝，本研究開展了家蠶BH4補救合成途徑相關(guān)酶，墨蝶呤還原酶(SPR)和二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因克隆、蛋白表達研究，并鑒定了兩種酶的酶學(xué)特征。
　　 本實驗首先將前期研究得到的重組質(zhì)粒pET-24b/BmSPR轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)，用IPTG進行了不同濃度和不同時間的誘導(dǎo)表達，優(yōu)化了蛋白的表達條件。SDS-PAGE電泳和WesternBlot的檢測結(jié)果表明家蠶SPR融合蛋

3、白能夠在原核表達系統(tǒng)中穩(wěn)定表達。根據(jù)已公布的家蠶基因組精細圖譜和EST等公共數(shù)據(jù)庫的序列信息，我們設(shè)計特異性引物克隆出家蠶BmDhfr基因的cDNA序列，獲得其ORF。該基因編碼185個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白分子量約為21.1kD。將擴增的ORF片段連接至pET-24b表達載體，并誘導(dǎo)其原核表達，經(jīng)免疫印跡檢測確認家蠶DHFR在E.coliBL21(DE3)菌株中也得到了正確表達。
　　 用Ni-NTA親和層析柱對BmSPR和Bm

4、DHFR重組蛋白進行純化，經(jīng)BCA法測定濃度后，對其酶活性進行分析。為進一步研究重組蛋白的最適反應(yīng)條件，本研究通過改變底物濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)液pH等因素，以觀察酶活性的變化情況。分析結(jié)果表明重組BmSPR和BmDHFR分別對其底物SP和二氫葉酸有較好的催化活性。
　　 家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲之一，并且日益成為基因工程的重要研究對象。本實驗利用具有培養(yǎng)操作簡單、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點的大腸桿菌表達系