腦心肌炎病毒VP1蛋白間接ELISA抗體檢測方法與滅活疫苗研究.pdf

1、腦心肌炎病毒（Encephalomycoarditis，EMCV）屬于微RNA病毒科心病毒屬，是一種無囊膜的單正股RNA病毒，可以感染昆蟲、爬行動物、嚙齒類動物和靈長類動物等，可以引起仔豬的致命性心肌炎和母豬的繁殖障礙。目前，我國豬群已有該病毒感染報道，但相關(guān)研究還不多。本文采用腦心肌炎病毒重組VP1蛋白，建立成功間接ELISA抗體檢測方法，并對EMCV滅活疫苗進行了初步研究。具體內(nèi)容如下:
　　 1.腦心肌炎病毒VP1基因的原

2、核表達與蛋白純化
　　 本研究根據(jù)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因序列設(shè)計引物，通過RT-PCR方法擴增獲得EMCV VP1基因，克隆至原核表達載體pET-32a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-VP1，經(jīng)酶切和測序鑒定，基因序列全長852bp。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠穩(wěn)定表達VP1蛋白。通過對誘導(dǎo)菌液濃度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時間的篩選，確定了EMCV VP1蛋白誘導(dǎo)表達的最佳條件，即菌液濃度1.0(OD

3、600)1.0mM IPTG誘導(dǎo)8小時表達效率較高。采用親和層析方法獲得純化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白具有良好反應(yīng)原性。
　　 2.腦心肌炎病毒VP1蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立和應(yīng)用
　　 本研究采用大腸桿菌表達的EMCV VP1蛋白，建立間接ELISA抗體檢測方法。優(yōu)化的反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為2μg/mL，血清稀釋度為1∶50，孵育時間1h，酶標SPA稀釋度為1

4、∶10000，作用時間為30 min。判定標準為:P/N值≧2.1，且OD450≧0.40為陽性，OD450≦0.30為陰性，介于二者之間的為可疑。該方法與CSFV、PRRSV、PCV2、PRV抗體反應(yīng)均呈陰性，證明其具有良好的特異性，采用該方法對江蘇省境內(nèi)7家規(guī)?；i場的115份血清樣品進行檢測，結(jié)果表明，EMCV已經(jīng)在江蘇地區(qū)規(guī)?；i場存在，血清抗體陽性率為13.0％。
　　 3.腦心肌炎病毒間接ELISA抗體檢測方法關(guān)鍵試

5、劑保存方法及其穩(wěn)定性的研究
　　 本研究選擇不同的抗原保護劑、血清保護劑、洗滌液保護劑分別處理ELISA方法關(guān)鍵試劑，測定其4℃保存時間。結(jié)果為:抗原包被的酶標板經(jīng)含10％硫酸銨的0.01mo/LTris-HCL緩沖液孵育45 min，4℃條件下可保存12個月;血清和洗滌液加入終濃度為0.2‰硫柳汞，4℃條件下可保存12個月以上。3批酶標SPA和TMB顯色液的穩(wěn)定性測定結(jié)果為:酶標SPA和TMB顯色液的批間和批內(nèi)變異系數(shù)均在10

6、％以內(nèi)。從而為EMCV抗體檢測試劑盒的研制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 4.腦心肌炎病毒滅活疫苗制備與免疫效力研究
　　 本研究使用終濃度為0.2mM的BEI對EMCV進行滅活處理，分別采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐劑配制成5種滅活疫苗。取6周齡Balb/c小鼠隨機分為7組，每組5只，第1～6組分別皮下免疫由以上5種佐劑配制的疫苗及未加佐劑的滅活抗原，第7組皮下注射2％ DMEM作為陰性對照，間

7、隔3周后進行加強免疫，0.2mL/只。首免后3、6周分別采血測其ELISA抗體水平和中和抗體水平，并分離脾臟細胞進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。首免后6周采用EMCV NJ08毒株進行攻毒，腹腔內(nèi)注射100LD50/只，觀察臨床癥狀和病理變化，并檢測腦組織中EMCV抗原。結(jié)果為:二免后3周各佐劑免疫組小鼠的ELISA抗體水平均達1∶1600以上，其中ISA15A、ISA201、GEL組的ELISA抗體水平均大于1∶3200;各佐劑組中和抗體水平相