豬腦心肌炎病毒GXLC株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的原核表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis viurs，EMCV)是RNA病毒科心病毒屬的成員，可以引起仔豬腦炎、心肌炎以及母豬繁殖障礙為特征的傳染病。本研究針對EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因設(shè)計了一對特異性的引物，采用RT-PCR方法擴增出831bp的完整VP1基因片段。將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建了EMCVVP1基因重組表達質(zhì)粒pET-32a-VP1。經(jīng)酶切、測序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3

2、)株感受態(tài)細胞，用IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示VP1蛋白獲得成功表達，融合蛋白的分子質(zhì)量約為52ku，表達的重組蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)Western-blot試驗，表明重組VP1蛋白與豬抗EMCV陽性血清發(fā)生特異性的免疫印跡反應。
　　 利用純化的重組蛋白VP1作為包被抗原，建立了用于檢測EMCV抗體的間接ELISA方法。經(jīng)優(yōu)化，獲得間接ELISA的最佳條件：以pH9.6、濃度為0.05mol/L的碳

3、酸鹽緩沖液做包被液；抗原包被濃度為0.625ug/mL，室溫作用2h后4℃包被過夜；待檢血清稀釋度為1:40，作用時間為60min；酶標二抗兔抗豬IgG-HRP工作濃度為1:6000，待檢血清與酶標二抗作用條件為37℃30min；底物在室溫避光條件顯色時間為15min；血清樣本陰陽性臨界值為0.33。特異性試驗表明重組VP1抗原與豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬口蹄疫的陽性血清無交叉反應。
　　 應用所建立的間接EL

4、ISA方法對廣西地區(qū)2010年-2011年的2228份豬血清樣品進行了EMCV抗體檢測，結(jié)果，被檢豬場的陽性率為100％，被檢血清樣品的陽性率為91.47％，其中仔豬的血清陽性率為43.14％，后備母豬的血清陽性率為84.7％,育成豬的血清陽性率為91.67％。表明廣西地區(qū)豬群已經(jīng)普遍感染EMCV。
　　 結(jié)果表明，本研究成功表達了豬EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1，建立了基于VP1蛋白的間接ELISA方法，開展了廣西地區(qū)豬群EMCV感染