玉米抗旱相關(guān)基因ZmVHA-A和ZmVHA-B的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、植物V-AFPase是一類特殊的膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于植物的液泡、質(zhì)膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、小泡等內(nèi)膜系統(tǒng)上。它的主要功能是催化水解ATP，跨細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)建立質(zhì)子電化學(xué)梯度，為次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，推動(dòng)相關(guān)離子和小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在植物的生長發(fā)育及適應(yīng)環(huán)境的變化中具有重要的作用。 盡管目前對(duì)于V-ATPase的結(jié)構(gòu)和亞基組成己作了大量研究，編碼亞基的基因也已經(jīng)從許多植物中克隆，但是關(guān)于V-ATPase亞基基因在不同逆境

2、下的表達(dá)與調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。且在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)V-ATPase亞基A基因(ZmVHA-A)受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。基于此本研究采用RACE技術(shù)對(duì)玉米V-ATPase A亞基基因(ZmVHA-A)進(jìn)行了克隆，分析了.ZmVHA-A基因在苗期水分脅迫，鹽脅迫、冷脅迫、外源ABA和花期水分脅迫下的表達(dá)特征；同時(shí)對(duì)V-ATPase的另一個(gè)關(guān)鍵亞基B基因(ZmVHA-B)進(jìn)行了克隆，并對(duì)ZmVHA-B基因在苗期水分脅迫，鹽脅迫、冷脅迫、外

3、源ABA和花期水分脅迫下的表達(dá)特征也進(jìn)行了分析；力圖通過對(duì)其關(guān)鍵亞基基因的分析闡釋V-ATPase在逆境下的調(diào)節(jié)及響應(yīng)機(jī)制。同時(shí)構(gòu)建ZmVHA-A：GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，對(duì)亞基A進(jìn)行了亞細(xì)胞定位的研究。最后把ZmVHA-A基因融合在35S啟動(dòng)子之下構(gòu)建了過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行過表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下： 1.利用RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds)策略，擴(kuò)增出ZmVHA

4、-A基因的5’端和3’端序列，然后用RT-PCR擴(kuò)增ZmVHA-A編碼框cDNA序列，編碼區(qū)長1863bp，編碼620個(gè)氨基酸，推測分子量為69KDa，等電點(diǎn)為5.36。同時(shí)通過RT-PCR獲得ZmVHA-B基因的編碼區(qū)序列，序列分析表明：該基因編碼487個(gè)氨基酸，蛋白分子量為54.09kD,等電點(diǎn)為4.99。 2.氨基酸同源性分析和聚類分析表明V-ATPase A和B亞基都是高度保守的蛋白亞基，且不同物種的V-ATPase亞基

5、A和B的同源性高低與生物進(jìn)化具有高度的相關(guān)性。結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明A亞基上存在兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域，B亞基上也同樣存在它發(fā)揮調(diào)節(jié)作用所必需的保守功能結(jié)構(gòu)域。 3.GFP融合標(biāo)記法對(duì)ZmVHA-A進(jìn)行定位分析，結(jié)果表明：當(dāng)GFP單獨(dú)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞時(shí)，GFP蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)；而融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，表明ZmVHA-A基因主要在細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。 4.Northe

6、rn雜交結(jié)果表明玉米ZmVHA-A和ZmVHA-B基因在花期水分脅迫下花絲中被誘導(dǎo)表達(dá)，在苗期ZmVHA-A和ZmVHA-B基因也對(duì)干旱、高鹽、低溫脅迫和ABA處理也做出了響應(yīng)，V-ATPase基因在這些脅迫過程中可能通過參與某些共同的調(diào)節(jié)通路參與逆境脅迫響應(yīng)。在苗期ZmVHA-A和ZmVHA-B基因都對(duì)(干旱)水分脅迫作出了響應(yīng)，它們的表達(dá)與葉片相對(duì)含水量并不成一一對(duì)應(yīng)關(guān)系； ZmVHA-A和ZmVHA-B這兩個(gè)基因都可被外源ABA誘