脫二氧喹賽多、脫二氧乙酰甲喹抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立.pdf

1、喹賽多和乙酰甲喹是人工合成的獸藥，屬于喹噁啉類藥物，具有良好的抗菌及促生長(zhǎng)作用，被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。研究表明，喹賽多與同類藥物相比毒性小、安全性較好，但其一些代謝產(chǎn)物多對(duì)動(dòng)物存在潛在毒性，會(huì)引起食品安全問題。乙酰甲喹的毒性相對(duì)較大，長(zhǎng)期使用或?yàn)E用會(huì)危害動(dòng)物和人類的健康。因此，建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法檢測(cè)動(dòng)物可食性組織中喹賽多和乙酰甲喹的殘留情況有重大意義。本研究分別以脫二氧喹賽多和脫二氧乙酰甲喹為研究對(duì)象，旨在建立一種快速、靈敏

2、、高通量的基于抗體的免疫學(xué)殘留檢測(cè)方法---酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
　　 脫二氧喹賽多(Cy4)是喹賽多的一種主要代謝產(chǎn)物，已被確定為其殘留標(biāo)志物。本論文根據(jù)脫二氧喹賽多的結(jié)構(gòu)特征，通過羧甲基羥胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，合成了免疫抗原Cy4-BSA和檢測(cè)抗原Cy4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后獲得了效價(jià)高、靈敏度較高的多克隆抗體，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤進(jìn)行細(xì)胞

3、融合，經(jīng)三次細(xì)胞克隆和篩選，獲得了3株能穩(wěn)定分泌Cy4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(A3C5、D9D2、F10D2)。制備了單克隆抗體腹水，并采用辛酸-飽和硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行純化。經(jīng)檢測(cè)，這三種雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的類型均為IgG2b，輕鏈為λ鏈，效價(jià)為1∶128000-1∶512000，且與其他結(jié)構(gòu)類似物基本沒有交叉反應(yīng)，特異性較好。
　　 本論文選用D9D2雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)方法的建立。通過優(yōu)化

4、各反應(yīng)條件建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ic-ELISA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的靈敏度(IC50)為50 ng/mL，靈敏度比多克隆抗體提高了200倍，線性范圍為(IC20-IC80)6.2-481.1 ng/mL。在雞肉中添加脫二氧喹賽多的量在4-4000μg/kg時(shí)，其回收率為71.36％-83.10％，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜10％。本研究建立了一種基于單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，其靈敏度高、特異性好，可用于檢測(cè)喹賽多在動(dòng)物可食性組織中

5、的殘留。
　　 脫二氧乙酰甲喹(M4)是乙酰甲喹的一種主要代謝產(chǎn)物，已被確定為其殘留標(biāo)志物。本論文根據(jù)脫二氧乙酰甲喹的結(jié)構(gòu)特征，通過羧甲基羥胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，合成了免疫抗原M4-BSA和檢測(cè)抗原M4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后獲得了多克隆抗體。經(jīng)檢測(cè)其效價(jià)為1∶16000-1∶32000，效價(jià)較高;靈敏度(IC50)為0.32μg/mL-12.38μg/mL;與少部分