PCV2感染、氧化應(yīng)激與硒的相互作用關(guān)系及其機理研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的豬傳染性疾病的病原，它與多種豬病的發(fā)生密切相關(guān)，如豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙、豬呼吸道綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎、滲出性皮炎和仔豬先天性震顫等，其中影響最為嚴重的是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征PMWS，該病已在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，但目前其致病機制還不是很清楚。已有研究表明，該病的發(fā)生還與氧化應(yīng)激有關(guān)。硒是動物和人所必需的微量元素之一，具有增強機體抗氧化能

2、力、提高機體免疫力、抵抗病毒感染等多種重要的生物學(xué)功能。當(dāng)前研究顯示，硒主要以硒半胱胺酸的形式摻入硒蛋白中，通過后者發(fā)揮其生物學(xué)功能，但對于很多硒蛋白具體的生物學(xué)功能與作用還有待于進一步地去研究、認識。富硒酵母主要含硒蛋氨酸，與無機硒（如亞硒酸鈉）相比，它具有毒性小、生物利用率高的特點。本論文主要對PCV2的感染和復(fù)制與宿主細胞氧化還原狀態(tài)之間的相互作用關(guān)系及其機理、硒影響PCV2感染與復(fù)制的機理、硒對PCV2感染陽性豬場斷奶仔豬生長、

3、抗氧化能力、PCV2感染水平以及免疫機能的影響進行了研究和探討，以期從宿主氧化應(yīng)激的角度闡述PCV2的致病機制，為硒特別是有機硒在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 試驗一:PCV2的感染和復(fù)制與宿主細胞氧化還原狀態(tài)之間的相互作用研究
　　 本試驗對PCV2的感染和復(fù)制與宿主細胞氧化還原狀態(tài)之間的相互作用關(guān)系進行了研究。試驗結(jié)果顯示，PCV2感染后48小時細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性

4、均顯著降低，而主要脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的濃度在PCV2感染后48小時顯著升高。GSH生成前體N-乙酰半胱氨酸NAC處理細胞能顯著增加細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的濃度，進而抑制PCV2的復(fù)制。相反，利用H2O2的氧化性降低細胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽(GSH)濃度能促進PCV2的復(fù)制。本試驗研究結(jié)果表明，PCV2感染改變了宿主細胞的氧化還原狀態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，同時，宿主細胞氧化還原狀態(tài)的改變也可影響PCV2的復(fù)制。
　　

5、試驗二:活性氧(ROS)通過NF-κB信號途徑調(diào)節(jié)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的復(fù)制
　　 研究表明，細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)對不同病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制有不同的影響。本試驗主要研究了活性氧(ROS)對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)在PK15細胞中復(fù)制的影響。試驗結(jié)果顯示，PCV2感染后PK15細胞中ROS水平升高，并隨著時間的推移而變化，在感染后72小時達到最高，而后逐漸下降。抗氧化物N-乙酰半胱氨酸NAC能夠降低PK15細胞內(nèi)的ROS

6、水平進而抑制PCV2的復(fù)制;相反地，還原型谷胱甘肽(GSH)合成酶抑制劑BSO則可提高PK15細胞內(nèi)的ROS水平并促進PCV2的復(fù)制。通過抑制劑BAY11-7082抑制NF-κB信號途徑的激活后發(fā)現(xiàn)，BSO誘導(dǎo)的ROS升高不再促進PCV2的復(fù)制。本試驗研究結(jié)果表明，PCV2感染本身會誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生ROS;ROS可通過NF-κB信號途徑調(diào)節(jié)PCV2的復(fù)制。
　　 試驗三:硒通過提高GPX1的表達阻斷氧化應(yīng)激對PCV2復(fù)制的促進作

7、用
　　 本試驗主要對PCV2復(fù)制、氧化應(yīng)激以及硒之間的相互作用關(guān)系進行了研究。通過測定PCV2的DNA拷貝數(shù)和PCV2陽性感染的細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能夠促進PCV2的復(fù)制;高劑量的硒蛋氨酸(6μM)能夠抑制PCV2的復(fù)制;而生理劑量的硒蛋氨酸（2或4μM）則能夠阻斷氧化應(yīng)激對PCV2復(fù)制的促進作用;PCV2感染PK15細胞后GPX1活性下降，但GPX1 mRNA水平卻在PCV2感染后顯著升高，該結(jié)果預(yù)示在PCV2

8、感染過程中GPX1可能對宿主細胞起到重要的保護作用。對GPX1進行RNA干擾后發(fā)現(xiàn)，硒蛋氨酸對氧化應(yīng)激促進PCV2復(fù)制的阻斷作用下降了，其表現(xiàn)與GPX1被干擾后硒蛋氨酸對GPX1表達的影響相一致，從而說明在硒阻斷氧化應(yīng)激促進PCV2復(fù)制的過程中，GPX1起著至關(guān)重要的作用。本試驗研究結(jié)果提示，PCV2感染后所導(dǎo)致的不同豬場發(fā)病率和死亡率的差異可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，而硒則具有預(yù)防控制PCV2感染的潛力。
　　 試驗四:硒對PCV2感

9、染陽性豬場斷奶仔豬生長性能、抗氧化性能及PCV2感染的影響
　　 從江蘇某PCV2感染陽性豬場選擇斷奶仔豬60頭，隨機分成5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)4頭，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別飼喂基礎(chǔ)日糧+亞硒酸鈉或富硒酵母，其中每種硒的添加濃度均為0.3和0.6 mg/kg。試驗結(jié)果表明，飼糧中添加不同形式不同水平的硒均可顯著改善飼料的報酬率，提高斷奶仔豬的日增重，降低料肉比;加硒提高了斷奶仔豬血清中的GPX和SOD活性，降低了血清

10、中的MDA含量，提高其抗氧化性能;加硒增加了血液中GPx1、GPx4、TR1等硒蛋白的mRNA水平。此外，添加不同濃度的亞硒酸鈉或富硒酵母均能夠顯著降低PCV2感染陽性豬場斷奶仔豬血液中的PCV2 DNA拷貝數(shù)。從改善機體抗氧化性能、提高硒蛋白mRNA水平以及抑制PCV2感染的效果來看，富硒酵母優(yōu)于亞硒酸鈉。
　　 試驗五:硒對PCV2感染陽性豬場斷奶仔豬免疫機能的影響
　　 從江蘇某PCV2感染陽性豬場選擇斷奶仔豬60

11、頭，隨機分成5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)4頭，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別飼喂基礎(chǔ)日糧+亞硒酸鈉或富硒酵母，其中每種硒的添加濃度均為0.3和0.6 mg/kg。試驗結(jié)果表明，飼料中添加不同濃度的亞硒酸鈉或富硒酵母均能夠顯著提高斷奶仔豬血清細胞因子IL-2和TNF-α的含量(P＜0.05);PCV2感染仔豬外周血液淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明，添加不同濃度的亞硒酸鈉或富硒酵母可以提高其淋巴細胞的增殖水平;從提高斷奶仔豬免疫機能的效果來看，富