絲蛋白基因的分子設(shè)計(jì)及過表達(dá)Ras1CA基因提高實(shí)用品種產(chǎn)絲量研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）屬鱗翅目蠶蛾科，可大規(guī)模飼養(yǎng)，遺傳背景比較清楚，其絲腺具有合成和分泌絲蛋白的能力。蠶絲有纖維皇后之美譽(yù)，但也存在易霉變，黃化、皺縮、褪色和脆化等缺陷。為了探討通過家蠶絲素基因（fib）的分子設(shè)計(jì)與遺傳改造，從基因水平改善絲纖維的性能，本研究利用家蠶絲素輕鏈基因（fib-L）上游約1.2kb的第5~6外顯子片段和約0.5kb的第7外顯子及其下游序列作為基因打靶的左右同源臂，將gfp基因和人工合成的家蠶抗菌肽基

2、因（cec）融合克隆插入到兩同源臂之間，并使其與fib-L基因處于同一讀碼框；將由ie-1驅(qū)動(dòng)的DsRed基因克隆至同源右臂右側(cè)，作為負(fù)選擇標(biāo)記，構(gòu)建基因打靶載體pSK-Fib.L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。將該載體轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光而無紅色熒光，表明載體構(gòu)建成功。將該載體通過精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)入家蠶卵，在G0代篩選繭呈綠色熒光的家蠶，PCR檢測(cè)證實(shí)篩選出的蠶為轉(zhuǎn)基因家蠶；同蛾

3、圈轉(zhuǎn)基因家蠶雜交傳代，用GFP抗體對(duì)G6代家蠶后部絲腺組織進(jìn)行western blot檢測(cè)，可觀察到Fib-L-GFP融合蛋白的特異性條帶；抗菌性實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)基因家蠶絲表面的菌落數(shù)明顯少于對(duì)照組；轉(zhuǎn)基因家蠶絲在紫外光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，表明通過基因打靶g(shù)fp-cec已與fib-L融合并表達(dá)。
　　為了探討提高實(shí)用品種的產(chǎn)絲水平和葉絲轉(zhuǎn)化率的可能性，將后部絲腺特異性表達(dá)Gal4的Fil-Gal4/3XP3-DsRed2轉(zhuǎn)基因家蠶系

4、與實(shí)用品種菁松回交6代，獲得Fil-Gal4轉(zhuǎn)基因家蠶菁松系統(tǒng)；將帶有UAS-Ras1CA元件的UAS-Ras1CA/3XP3-EGFP轉(zhuǎn)基因家蠶系與實(shí)用品種皓月回交6代，獲得UAS-Ras1CA轉(zhuǎn)基因家蠶皓月系統(tǒng)。將Gal4菁松系與UAS皓月系雜交，得到在后部絲腺特異性表達(dá)Ras1CA的轉(zhuǎn)基因?qū)嵱闷贩NFil-Gal4-菁松×UAS-Ras1CA-皓月，調(diào)查結(jié)果顯示，與菁松×皓月相比，轉(zhuǎn)基因家蠶的的后部絲腺重和蠶絲產(chǎn)量分別提高了11%、