家蠶后部絲腺基因表達差異的分析與蠶絲性能改良的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目泌絲型經(jīng)濟昆蟲，絲腺是合成分泌絲蛋白、決定蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量的重要組織器官。絲腺具有高效合成絲蛋白的能力，但采用家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達外源蛋白時，至今為止的所有實驗結(jié)果都證明外源蛋白的表達量很低，極大多數(shù)僅占繭絲蛋白含量的百分之幾。為了利用具有極強機械性能的黑寡婦蜘蛛牽引絲改良家蠶絲纖維的機械性能，本研究采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)研究了家蠶后部絲腺基因表達調(diào)控的特征，初步揭示了絲腺高效合成絲蛋白的分子機制，提供了利用絲腺高

2、效表達蜘蛛絲蛋白的方法和策略;本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建了含有蜘蛛絲蛋白的家蠶品種，極大地改良了蠶絲的機械性能。具體取得的研究結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)錄組學分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路
　　以秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個家蠶品種5齡第3天后部絲腺為材料，采用RNA-seq高通量測序的轉(zhuǎn)錄組研究方法，結(jié)果表明Nd和Nd-s這2個低絲量的突變品種中，組成繭絲蛋白基因的表達水平下降，導致絲產(chǎn)量降低;與絲腺生長發(fā)育

3、相關(guān)的基因表達下調(diào)，阻礙了絲腺的發(fā)育，影響了絲蛋白的正常合成;絲腺組織中合成了大量不成熟的、錯誤折疊的蛋白，造成蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)和抗氧化代謝等一系列耗能的代謝增加，大量的能量被空耗在用來維持細胞自身的穩(wěn)態(tài)上面，最終影響了絲蛋白的合成代謝。
　　2.蛋白質(zhì)組學分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路
　　采用轉(zhuǎn)錄組學分析相同的實驗材料，用同位素標記定量法(Isobaric tags forrelative and absolute

4、 quantitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學技術(shù)進行分析得知，Nd和Nd-s這2個低絲量的突變品種的繭絲關(guān)鍵蛋白表達量下降，絲腺發(fā)育相關(guān)的蛋白表達下調(diào)，絲蛋白合成及信號通路相關(guān)的蛋白表達下調(diào)，絲蛋白的分泌及運輸途徑相關(guān)的蛋白也受到影響，大量的能量被空耗到無效的代謝途徑上，最終影響了絲蛋白的高效合成。
　　3.采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良了家蠶繭絲的機械性能
　　以piggyBac載體為基礎(chǔ)，根據(jù)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白設(shè)計并成功構(gòu)建

5、了包含不同重復單元的類MaSp1和MaSp2的系列載體，利用顯微注射的方法，將其整合到家蠶的基因組內(nèi)，經(jīng)Inverse-PCR、Q-PCR、Western blotting等方法的檢測，證明已成功獲得了16個轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品系。這些品系的繭絲的機械性能顯著提高，與野生型對照品種相比，最大應(yīng)力最高提高71.92％，最大應(yīng)變提高34.508％，楊氏模量提高57.819％，韌性最高提高131.673％。
　　4.證明了羆寡婦蜘蛛牽引絲

6、的機械性能與其蛋白分子量大小成極顯著的線性關(guān)系
　　采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了類黑寡婦蜘蛛Black Widow Spider，Latrodectushesperus牽引絲MaSp1基因不同長度的分子的轉(zhuǎn)基因蜘蛛絲家蠶，根據(jù)多個轉(zhuǎn)基因家系以及雜合型和純化型2種基因型對比研究結(jié)果，都證明了分子越長絲的機械性能越好，說明黑寡婦蜘蛛牽引絲的超級性能來源于她的分子長度，暗示了自然界機械性能優(yōu)良的蛋白性絲纖維都采用高度重復的大分子蛋白的策略是生物

7、進化的一種必然結(jié)果。
　　綜上所述，本研究通過對秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個家蠶品種的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異表達譜分析，揭示了絲蛋白高效合成的機制，為改良家蠶絲腺特性，作為生物反應(yīng)器高效地合成外源蛋白奠定了分子基礎(chǔ)。本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品種，顯著提高了家蠶繭絲的機械性能，并證明了絲纖維的機械性能與組成其蛋白分子量之間呈極顯著的線性關(guān)系，為進一步改良蠶絲質(zhì)量奠定了堅實的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果揭示了如果能夠