小菜蛾氨肽酶N2和ABC轉(zhuǎn)運蛋白C2在Cry1Ac抗性中的作用.pdf

1、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是十字花科蔬菜最主要的害蟲之一。小菜蛾生長周期短，繁殖率高，適應(yīng)性強，世代重疊嚴重，可以長距離遷飛，故其田間防治的難度系數(shù)較大。目前，小菜蛾已對包括Bt制劑在內(nèi)的至少84種藥劑產(chǎn)生了抗性，據(jù)估計全球每年小菜蛾為害造成的損失在40-50億美元，抗性治理形勢不容樂觀。
　　蘇云金芽孢桿菌在產(chǎn)生孢子的過程中有伴孢晶體的形

2、成，這些伴孢晶體具有一定的殺蟲作用，稱之為殺蟲晶體蛋白，即Bt毒素。作為首個對微生物農(nóng)藥Bt制劑產(chǎn)生抗藥性的物種，眾多昆蟲學(xué)和毒理學(xué)研究人員對小菜蛾的抗藥性問題給予高度重視并進行了大量的抗性調(diào)查和研究工作。本文系統(tǒng)研究了PxAPN2基因在小菜蛾抗性和敏感品系四齡幼蟲中腸內(nèi)的mRNA表達量，以及其表達量變化對小菜蛾Cry1Ac抗性水平的影響;克隆了抗性和敏感品系中ABC轉(zhuǎn)運蛋白C2基因（PxABCC2），研究了其在四齡幼蟲中腸內(nèi)的mRNA

3、表達量，并利用分子標記技術(shù)確定了PxABCC2基因與Bt抗性的不完全連鎖關(guān)系。
　　1.小菜蛾P(guān)xAPN2基因mRNA表達水平下降與Cry1Ac抗性的相關(guān)性
　　利用定量PCR技術(shù)研究了小菜蛾的PxAPN2基因在Cry1AC抗性品系SZBT、敏感品系ROTH以及抗性對照品系SZ中的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對于敏感品系ROTH，對照品系SZ的PxAPN2基因表達量為其0.95倍，而抗性品系SZBT中該基因表達量則為其0.51倍。利

4、用體外合成的dsRNA，對敏感品系的PxAPN2基因進行干擾，結(jié)果表明:喂食dsRNA的小菜蛾三齡幼蟲的PxAPN2基因的表達量分別下調(diào)30％、57％，對Cry1Ac分別產(chǎn)生4.3、6.9倍的抗性，隨著干擾效率的升高，小菜蛾對毒素的抗性也相應(yīng)提高。
　　2.RNAi敲減各品系PxAPN2基因的表達對Cry1Ac敏感性的影響
　　將含有PxAPN2基因dsRNA的菌液以及含有綠色熒光蛋白(GFP)dsRNA的菌液喂食到三個品系

5、小菜蛾3齡幼蟲體內(nèi)，以研究PxAPN2基因沉默后對Cry1Ac毒力的影響。對敏感品系ROTH的干擾，相對于只喂食綠色熒光蛋白(GFP)為靶基因的dsGFP的小菜蛾敏感品系(CK)，喂食表達dsAPN2的細菌液的小菜蛾三齡幼蟲的PxAPN2基因的表達量分別下調(diào)25％、35％，干擾后3齡小菜蛾幼蟲對Cry1Ac分別產(chǎn)生3.4、3.8倍的抗性;對對照品系SZ的干擾，PxAPN2基因的表達量分別下調(diào)31％、32％，對Cry1Ac分別產(chǎn)生3.4、

6、2.6倍的抗性;對抗性品系SZBT的干擾，PxAPN2基因的表達量分別下調(diào)20％、23％，對Cry1Ac分別產(chǎn)生2.1、2.2倍的抗性。上述結(jié)果表明，對小菜蛾P(guān)xAPN2不同表達水平的3個品系分別進行RNAi敲減，均可導(dǎo)致Cry1Ac抗性水平增加。該研究結(jié)果進一步證實PxAPN2的表達量降低與小菜蛾對Cry1Ac的抗性相關(guān)。
　　3.小菜蛾P(guān)xABCC2基因的克隆及在各品系間的表達量比較
　　克隆了小菜蛾P(guān)xABCC2基因的

7、全長cDNA，該基因編碼1332個氨基酸。通過比對抗性和敏感品系個體的PxABCC2基因序列，沒有發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的突變位點。采用比較CT值的相對定量法（2-ΔΔCT法），研究了該基因在小菜蛾不同品系（抗性品系、敏感品系和對照品系）中的表達量。結(jié)果表明:相對于敏感品系ROTH，對照品系PxABCC2基因的表達量為其1.4-1.5倍，而抗性品系SZBT的表達量則為其3.2-3.4倍。
　　4.PxABCC2基因與Cry1Ac抗性的遺傳