棉鈴蟲氨肽酶N毒素結(jié)合區(qū)片段對Cry1Ac增效的研究.pdf

1、棉鈴蟲的抗性演化是轉(zhuǎn)Bt棉花能夠長期有效種植的潛在風(fēng)險(xiǎn)，增效蛋白的應(yīng)用作為抗性治理策略的一個方面，能夠?yàn)檠泳徝掴徬x抗性演化提供方法。鈣粘蛋白和氨肽酶N均是Cry1A毒素在鱗翅目害蟲中的受體。有研究報(bào)道了原核表達(dá)的鈣粘蛋白(cadherin，Cad)及氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)受體的毒素結(jié)合區(qū)片段顯著增強(qiáng)了Cry1A毒素的效果。本文通過對棉鈴蟲氨肽酶N毒素結(jié)合區(qū)片段對Cry1Ac增效的研究，主要得到了以下結(jié)果：<

2、br>　　 1.通過基因克隆和原核表達(dá)，得到了棉鈴蟲氨肽酶N毒素結(jié)合區(qū)APN1tb片段，分子量大小為28 kDa，是預(yù)測分子量的兩倍。通過鎳親和純化得到APN1tb純化片段，通過Western blot檢測分析，發(fā)現(xiàn)APN1tb純化片段主要以二聚體形式存在，且存在少量的四聚體和八聚體；
　　 2.在Cry1Ac活化毒素中加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段對棉鈴蟲初孵幼蟲的生測結(jié)果表明，單獨(dú)Cry1 Ac活化毒素對幼蟲的死

3、亡率為44.44±6.056％，而加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段后幼蟲死亡率分別為66.67±2.405％、91.66±4.167％、91.67±4.812％，表明APN1tb片段顯著增強(qiáng)了Cry1Ac毒素對棉鈴蟲幼蟲的毒性；
　　 3.原核表達(dá)及純化得到棉鈴蟲氨肽酶N毒素結(jié)合區(qū)缺失片段APN1tb-Del，分子量大小為20 kDa，同樣是預(yù)測分子量的兩倍。通過鎳親和純化得到APN1tb-Del純化片段，通過Weste

4、rn blot檢測分析，發(fā)現(xiàn)APN1tb純化片段同樣主要以二聚體形式存在，且存在少量的四聚體；
　　 4.通過比較APN1tb片段和APN1tb-Del片段對Cry1Ac毒素毒性的影響，生測結(jié)果表明：APN1tb片段能夠顯著增強(qiáng)Cry1Ac毒素對棉鈴蟲幼蟲的毒性，而缺失了結(jié)合區(qū)的APN1tb-Del片段失去了對Cry1Ac毒素增效的能力；
　　 5.分別通過ELISA和流式細(xì)胞術(shù)比較了APN1tb片段和APN1tb-De

5、l片段與Cry1Ac毒素的結(jié)合及與刷狀緣膜囊泡(BBMV)的結(jié)合，結(jié)果表明APN1tb片段能夠與Cry1Ac高親和性結(jié)合，而APN1tb-Del片段不能與Cry1Ac毒素結(jié)合；APN1tb片段和APN1tb-Del片段均能與BBMV結(jié)合；
　　 6.通過包涵體處理及鎳親和純化得到APN1tb-Ⅰ片段，在Cry1Ac活化毒素中加入5倍、15倍及50倍APN1tb-Ⅰ片段對棉鈴蟲初孵幼蟲的生測結(jié)果表明，單獨(dú)Cry1Ac活化毒素對幼蟲

6、的死亡率為48.61±6.054％，而加入5倍、15倍及50倍APN1tb片段后幼蟲死亡率均為98.61±1.389％，表明APN1tb-Ⅰ片段顯著增強(qiáng)了Cry1Ac毒素對棉鈴蟲幼蟲的毒性，且增效能力比APN1tb片段強(qiáng)；
　　 7.通過ELISA分析了APN1tb片段和APN1tb-Ⅰ片段與Cry1Ac毒素的結(jié)合能力，結(jié)果表明兩者都能與毒素高親和性結(jié)合，但APN1tb-Ⅰ片段的結(jié)合能力比APN1tb片段強(qiáng)，這一結(jié)果可能揭示了A

7、PN1tb-Ⅰ片段增效能力更強(qiáng)的原因。
　　 綜上所述，原核表達(dá)的APN1tb片段顯著增強(qiáng)了Cry1Ac毒素對棉鈴蟲幼蟲的毒性，我們假定了APN1tb片段增效的機(jī)理：因?yàn)锳PN1tb片段自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，能夠形成二聚體或多聚體，而其能夠與BBMV結(jié)合，推測其可能通過同源聚合而結(jié)合到BBMV上GPI錨定的APN受體；APN1tb片段又能夠與Cry1Ac毒素結(jié)合，因此APN1tb片段可能作為毒素和受體中間的橋梁，使更多的毒素與受體結(jié)合