Hedgehog信號通路對家蠶脂肪細胞分化發(fā)育的調控機制研究.pdf

1、從脊椎動物到無脊椎動物，Hh信號通路廣泛存在并高度保守，在動物胚胎多種組織器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Hh信號通路在不同的靶細胞中發(fā)揮著不同的作用。Hh以及它下游信號分子的變異與多種癌癥等疾病的發(fā)生有關。因此，研究Hh信號通路的轉導機制對于了解動物體的生長發(fā)育機制以及某些疾病的發(fā)生都有著重要意義。近年來，越來越多的研究表明，Hh信號通路能夠調控動物脂肪細胞的生長發(fā)育，至于它在不同物種中的調控作用是否一致尚有爭議。
　　作為一種重要的

2、經(jīng)濟昆蟲，家蠶不僅是鱗翅目昆蟲的典型模式生物，同時也是開發(fā)新一代生物反應器的重要材料。脂肪體是家蠶體內重要的組織器官，它既是糖類、脂類和蛋白質等物質的合成和代謝中心，還具有貯存營養(yǎng)、解毒以及為生命周期活動提供各種生物合成的代謝產(chǎn)物等生理功能。家蠶脂肪體遍布其整個體腔，具有類似哺乳動物肝臟和腎臟的功能。脂肪體內貯存物質豐富與否與幼蟲生長發(fā)育及變態(tài)、成蟲產(chǎn)卵量和卵質量好壞都有密切關系。因此，本文主要研究Hh信號通路對于家蠶脂肪細胞分化發(fā)育的

3、調控作用。
　　本研究所涉及到的基因包括:Ⅰ.Hedgehog信號通路的組成基因:分泌蛋白Hh、受體Ptch和Smo、下游轉錄因子Ci以及Fu、Cos2。Ⅱ.脂肪酸結合蛋白AP2，它主要在脂肪細胞中作為脂質伴侶而表達，它的表達量能夠在一定程度上表明脂肪的含量。
　　本研究包括以下五部分內容:
　　(1).克隆并鑒定家蠶Hh信號通路的組成基因(Hh、Ptch、Smo、Ci、Fu、 Cos2)以及脂肪標記基因AP2。對Hh

4、進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，家蠶Hh蛋白與其它物種（如斑馬魚、果蠅、小鼠和人等）Hh蛋白的氨基酸序列均高度相似，證明了Hh蛋白是一種比較保守的蛋白質。
　　(2).Hh信號通路在家蠶幼蟲不同生長時期和不同組織中的表達情況分析。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Hh信號通路在家蠶幼蟲不同生長時期活性不同，其中胚胎期活性最高，隨著幼蟲生長其活性逐漸降低，這表明Hh信號通路主要在家蠶胚胎期起作用。同時，在家蠶不同組織的檢測表明，Hh信號通路在

5、新陳代謝旺盛的組織中活性較高，如絲腺、脂肪體和性腺等。此外，通過對家蠶幼蟲三個不同時期（五齡第1天、熟蠶、蛹）脂肪體中Hh信號通路活性的檢測，發(fā)現(xiàn)Hh信號通路在家蠶脂肪體快速生長或解離的時期如五齡初期、蛹期活性很高，而在其沒有明顯變化的時期如熟蠶期活性較低，說明Hh信號通路在家蠶脂肪形成中起著重要作用。
　　(3).在BmN細胞系中進行Hh基因的過表達和干擾實驗，來檢測Hh基因對該通路下游基因以及脂肪標記基因AP2的調控。利用改良

6、后的piggyBac轉座載體將外源Hh基因插入BmN細胞基因組中，篩選鑒定后得到穩(wěn)定的Hh過表達轉基因細胞系。同時，體外合成dsRNA轉染BmN細胞來抑制Hh基因的表達。對比Hh過表達和RNAi結果，發(fā)現(xiàn)在Hh信號通路中，Smo、Ci、Fu為正調控因子，Ptch和Cos2為負調控因子，并且Hh信號通路抑制AP2基因的表達。
　　(4).藥物處理—體外實驗。利用環(huán)杷明（Hh通路特異性拮抗劑）處理家蠶體外原代培養(yǎng)脂肪細胞。結果表明:環(huán)

7、杷明抑制家蠶體外培養(yǎng)脂肪細胞中Hh信號通路的表達，促進AP2的表達;觀察脂肪細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明處理明顯加快脂肪細胞的分化。說明在家蠶體外培養(yǎng)脂肪細胞中，Hh信號通路受到抑制會促進脂肪細胞的分化。
　　(5).藥物處理—體內實驗。四齡起家蠶幼蟲每天添食一定量的環(huán)杷明，三天后取脂肪體進行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Hh信號通路表達水平受到抑制。連續(xù)添食至五齡第1天，取幼蟲脂肪體做石蠟切片觀察脂肪細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明處理明顯促進家蠶幼蟲