2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 MSC/IISC共培養(yǎng)體系中Hedgehog信號(hào)通路的活性 材料與方法 1.細(xì)胞來源1)激活型人HSC(由Division of Gastroenterology,Department of Medicine,Duke University Medical Center,Durham,NC,USA提供)2)人L-02肝細(xì)胞株(由Division of Gastroenterology,Departmen

2、t of Medicine,Duke University Medical Center,Durham,NC,USA提供)3)人MSC:采自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床無血液疾病志愿者髂骨內(nèi)骨髓,共10例(男性6例、女性4例) 2、MSC/HSC共培養(yǎng)體系的建立根據(jù)孔徑0.4μm的tanswellinsert半透膜僅可以通過培養(yǎng)液而不能透過細(xì)胞的特點(diǎn),在6孔塑料培養(yǎng)板上架起tanswellinser半透膜,建立雙層細(xì)胞共用培養(yǎng)液而不

3、直接接觸的培養(yǎng)體系。利用tanswell作為培養(yǎng)體系上層,接種第3代MSC:2x104cells:培養(yǎng)體系下層為6孔塑料培養(yǎng)板接種第5代的HSC:2x104 Cells。均采用置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)液為含5%小牛血清L-DMEM。人L-02肝細(xì)胞為對(duì)照組 3、MSC與HSC的Hh通路相關(guān)蛋白測(cè)定 3.1 RT—PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系中MSC與HSC的Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白(Shh、-1hh),受

4、體(Ptc、Smo)、轉(zhuǎn)錄因子(Gli 1、Gli 2、Gli 3)表達(dá)。 3.2 RT-PCR及免疫印跡法測(cè)定共培養(yǎng)第1天與第7天HSC的總shh mRNA 4、Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli 1的表達(dá)當(dāng)Hh蛋白與Hh通路受體后,可促使受體下游轉(zhuǎn)錄因子Gli(Glil、Gli2、Gli3)激活、啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗調(diào)亡因子等的轉(zhuǎn)錄。 4.1.GH 1基因表達(dá):通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系

5、,可以極其靈敏、高效地檢測(cè)Glil基因的表達(dá)。我們將Gli1-熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染MSC。在轉(zhuǎn)染MSC培養(yǎng)皿中加入外源性重組人Shh因子,共培養(yǎng)24h后行熒光素酶檢測(cè)Gli1基因的表達(dá)。 (1)實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)染的lMSC根據(jù)是否加入外源性shh因子分為2組: ①shh/轉(zhuǎn)染MSC組,培養(yǎng)板接種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MSC:2x104cells,加入20um外源性shh因子; ②對(duì)照組:轉(zhuǎn)染MSC以2

6、x104cells單獨(dú)培養(yǎng)。 (2)培養(yǎng)24h后測(cè)定2組細(xì)胞熒光素酶的活性,檢測(cè)Glil基因的表達(dá)。 4.2 Gli1 mRNA的表達(dá)培養(yǎng)板接種第5代MSC 2x104 cells,加入20um外源性shh因子共培養(yǎng)6h,用TRlzol提取總mRNA,用RT-PCR檢測(cè)Gill mRNA的表達(dá)。 5、Hh信號(hào)通路活性與MSC增殖凋亡的關(guān)系當(dāng)Hh蛋白與Hh通路受體結(jié)合后,可促使受體下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli(Gli1、G

7、li2、Gli3)激活、啟動(dòng)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗調(diào)亡因子等的轉(zhuǎn)錄,從而使:MSC增殖,并且凋亡活性降低。加入外源性Shh與cyclopamine(Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑)可測(cè)定Hh通路活性與MSC增殖凋亡的關(guān)系。 5.1實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)是否加入cyclopamine(Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑)與外源性shh,將MSC分為3組: ①對(duì)照組:單純MSC組:96孔培養(yǎng)板單獨(dú)接種第5代MSC 50

8、00cells/well。 ②shh/MSC組:96孔培養(yǎng)板接種第5代MSC 5000cellsdwell,24h后加入20um重組人shh因子,共培養(yǎng)48h。 ③cyclopamine/shh/MSC組:96孔培養(yǎng)板接種第5代MSC 5000cells/well,加入10um cyclopamine混勻處理30min,然后加入20urn重組人shh因子共培養(yǎng)48h。 5.2用Brdu免疫組織化學(xué)染色分析3組MS

9、C增殖情況的改變。 5.3凋亡蛋白(Caspase-3/7)檢測(cè):運(yùn)用Apo-ONE~Homogeneous Caspase-3/7Assay試劑盒檢測(cè)。分別檢測(cè)shh/MSC組與單存MSC組的凋亡蛋白Caspase-3/7。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS 10.0 for Windows軟件處理,采用t檢測(cè)與方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義二 結(jié)果

10、1.HSC和MSC均表達(dá)m通路相關(guān)蛋白基因shh、Ihh、受體Patched(Pte)、Smoothened(Smo)以及轉(zhuǎn)錄因子Gli(Gli1、Gli2、Gli3)。成熟的肝細(xì)胞不表達(dá)Hh通路蛋白mRNA。 2.RT-PCR與免疫印跡法檢測(cè):與MSC共培養(yǎng)7天后HSC的shh mRNA與shh蛋白含量較第1天顯著升高(P<0.05)。 3.轉(zhuǎn)染Gli1報(bào)告基因載體的MSC組加入外源性Shh后,熒光素酶測(cè)定提示Gli1

11、基因表達(dá)活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(p<0.05);RT-PCR分析提示Gli1 mRNA的定量較對(duì)照組明顯升高(p<0.05)。 第二部分 Hh信號(hào)介導(dǎo)的HSC對(duì)MSC的調(diào)控作用 材料與方法 1、HSC對(duì)MSC增殖凋亡的影響 1.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組:MSC/HSC共培養(yǎng),孔徑0.4μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層,直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層,HSC和MSC以2×104的量

12、分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ②對(duì)照組(MSC/MSC): MSC以2x104的量接種于培養(yǎng)皿和Transwell中。 1.2 MSC增殖檢測(cè):共培養(yǎng)7天后,利用Brdu免疫組織化學(xué)染色分析檢測(cè)各組中MSC增殖情況的改變。 1.3 MSC凋亡檢測(cè):凋亡蛋白檢測(cè)(Caspase-3/7):運(yùn)用Apo-ONE(R) Homogeneous Caspase-3/7 Assay試劑盒檢測(cè)。分別檢測(cè)對(duì)照組B與實(shí)

13、驗(yàn)組MSC的凋亡蛋白Caspase-3/7。 1.4 GLil mRNA定量分析:RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組B與實(shí)驗(yàn)組MSC的GLil mRNA定量。 2.Hh信號(hào)通路活性對(duì)MSC增殖與凋亡的影響 2.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組:MSC/HSC共培養(yǎng)體系中加A.20ug anti-Shh中和抗體,培養(yǎng)24h。 ②對(duì)照組:MSC/HSC共培養(yǎng)體系中加入無免疫源性的IgG抗體,培養(yǎng)24h。 2.2 Br

14、du免疫組織化學(xué)染色分析:觀察比較2組MSC增殖情況的改變。 3、HSC對(duì)MSC分化的影響 3.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組:MSC/HSC共培養(yǎng),孔徑0.4μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層,直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層,HSC和MSC以2x104的量分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ②陰性對(duì)照組:MSC/MSC共培養(yǎng),孔徑0.4/μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層,直徑6cm的塑

15、料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層,MSC以2x104的量分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ③陽性對(duì)照組:L-02人肝細(xì)胞株。 注:兩組培養(yǎng)基中均不加防止細(xì)胞分化的LIF。 3.2各組在共培養(yǎng)第7天行免疫細(xì)胞化學(xué)染色;第14天行免疫熒光染色;第7天行PT-PCR檢測(cè)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS 10.0 for Windows軟件處理,采用t檢測(cè)與方差分

16、析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、結(jié)果 1.與對(duì)照組相比, MSC/HSC共培養(yǎng)體系中MSC的增殖明顯活躍; MSC凋亡蛋白活性顯著降低; MSC的GLil mRNA定量明顯增加(p<0.05)。 2.與對(duì)照組相比,在MSC/HSC共培養(yǎng)體系加入anti-Shh中和抗體后, MSC的增殖受到明顯抑制(p<0.05)。 3.MSC/HSC共培養(yǎng)7天后,免疫細(xì)胞化學(xué)染色提示MSC的AFP和CK18均為陽性

17、著色。L-02人肝細(xì)胞株為陽性對(duì)照。 4.MSC/HSC共培養(yǎng)14天后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色提示MSC的AFP和ALB熒光染色均為陽性。 5.MSC/HSC共培養(yǎng)7天后,RT-PCR顯示MSC分泌肝細(xì)胞特征性蛋白AFP和ALB。 結(jié)論 1.MSC/HSC共培養(yǎng)體系中,Hh信號(hào)通路呈高度活化狀態(tài):激活型HSC表達(dá)Hh信號(hào)通路蛋白(Shh),MSC表達(dá)Hh信號(hào)通路受體Patched(Ptc)和Smoothen

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