從Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路角度研究HSC對(duì)MSC的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第一部分 MSC／IISC共培養(yǎng)體系中Hedgehog信號(hào)通路的活性 材料與方法 1.細(xì)胞來源1)激活型人HSC(由Division of Gastroenterology，Department of Medicine，Duke University Medical Center，Durham，NC，USA提供)2)人L-02肝細(xì)胞株(由Division of Gastroenterology，Departmen

2、t of Medicine，Duke University Medical Center,Durham，NC，USA提供)3)人MSC：采自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床無血液疾病志愿者髂骨內(nèi)骨髓，共10例(男性6例、女性4例) 2、MSC／HSC共培養(yǎng)體系的建立根據(jù)孔徑0.4μm的tanswellinsert半透膜僅可以通過培養(yǎng)液而不能透過細(xì)胞的特點(diǎn)，在6孔塑料培養(yǎng)板上架起tanswellinser半透膜，建立雙層細(xì)胞共用培養(yǎng)液而不

3、直接接觸的培養(yǎng)體系。利用tanswell作為培養(yǎng)體系上層，接種第3代MSC：2x104cells：培養(yǎng)體系下層為6孔塑料培養(yǎng)板接種第5代的HSC：2x104 Cells。均采用置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含5％小牛血清L-DMEM。人L-02肝細(xì)胞為對(duì)照組 3、MSC與HSC的Hh通路相關(guān)蛋白測(cè)定 3.1 RT—PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系中MSC與HSC的Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白(Shh、-1hh)，受

4、體(Ptc、Smo)、轉(zhuǎn)錄因子(Gli 1、Gli 2、Gli 3)表達(dá)。 3.2 RT-PCR及免疫印跡法測(cè)定共培養(yǎng)第1天與第7天HSC的總shh mRNA 4、Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli 1的表達(dá)當(dāng)Hh蛋白與Hh通路受體后，可促使受體下游轉(zhuǎn)錄因子Gli(Glil、Gli2、Gli3)激活、啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗調(diào)亡因子等的轉(zhuǎn)錄。 4.1.GH 1基因表達(dá)：通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系

5、，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)Glil基因的表達(dá)。我們將Gli1-熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染MSC。在轉(zhuǎn)染MSC培養(yǎng)皿中加入外源性重組人Shh因子，共培養(yǎng)24h后行熒光素酶檢測(cè)Gli1基因的表達(dá)。 (1)實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染的lMSC根據(jù)是否加入外源性shh因子分為2組： ①shh／轉(zhuǎn)染MSC組，培養(yǎng)板接種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MSC：2x104cells，加入20um外源性shh因子； ②對(duì)照組：轉(zhuǎn)染MSC以2

6、x104cells單獨(dú)培養(yǎng)。 (2)培養(yǎng)24h后測(cè)定2組細(xì)胞熒光素酶的活性，檢測(cè)Glil基因的表達(dá)。 4.2 Gli1 mRNA的表達(dá)培養(yǎng)板接種第5代MSC 2x104 cells，加入20um外源性shh因子共培養(yǎng)6h，用TRlzol提取總mRNA，用RT-PCR檢測(cè)Gill mRNA的表達(dá)。 5、Hh信號(hào)通路活性與MSC增殖凋亡的關(guān)系當(dāng)Hh蛋白與Hh通路受體結(jié)合后，可促使受體下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli(Gli1、G

7、li2、Gli3)激活、啟動(dòng)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗調(diào)亡因子等的轉(zhuǎn)錄，從而使：MSC增殖，并且凋亡活性降低。加入外源性Shh與cyclopamine(Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑)可測(cè)定Hh通路活性與MSC增殖凋亡的關(guān)系。 5.1實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)是否加入cyclopamine(Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑)與外源性shh，將MSC分為3組： ①對(duì)照組：單純MSC組：96孔培養(yǎng)板單獨(dú)接種第5代MSC 50

8、00cells／well。 ②shh／MSC組：96孔培養(yǎng)板接種第5代MSC 5000cellsdwell，24h后加入20um重組人shh因子，共培養(yǎng)48h。 ③cyclopamine／shh／MSC組：96孔培養(yǎng)板接種第5代MSC 5000cells／well，加入10um cyclopamine混勻處理30min，然后加入20urn重組人shh因子共培養(yǎng)48h。 5.2用Brdu免疫組織化學(xué)染色分析3組MS

9、C增殖情況的改變。 5.3凋亡蛋白(Caspase-3／7)檢測(cè)：運(yùn)用Apo-ONE~Homogeneous Caspase-3／7Assay試劑盒檢測(cè)。分別檢測(cè)shh／MSC組與單存MSC組的凋亡蛋白Caspase-3／7。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 10.0 for Windows軟件處理，采用t檢測(cè)與方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義二 結(jié)果

10、1.HSC和MSC均表達(dá)m通路相關(guān)蛋白基因shh、Ihh、受體Patched(Pte)、Smoothened(Smo)以及轉(zhuǎn)錄因子Gli(Gli1、Gli2、Gli3)。成熟的肝細(xì)胞不表達(dá)Hh通路蛋白mRNA。 2.RT-PCR與免疫印跡法檢測(cè)：與MSC共培養(yǎng)7天后HSC的shh mRNA與shh蛋白含量較第1天顯著升高(P<0.05)。 3.轉(zhuǎn)染Gli1報(bào)告基因載體的MSC組加入外源性Shh后，熒光素酶測(cè)定提示Gli1

11、基因表達(dá)活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(p<0.05)；RT-PCR分析提示Gli1 mRNA的定量較對(duì)照組明顯升高(p<0.05)。 第二部分 Hh信號(hào)介導(dǎo)的HSC對(duì)MSC的調(diào)控作用 材料與方法 1、HSC對(duì)MSC增殖凋亡的影響 1.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組：MSC／HSC共培養(yǎng)，孔徑0.4μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層，直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層，HSC和MSC以2×104的量

12、分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ②對(duì)照組(MSC／MSC)： MSC以2x104的量接種于培養(yǎng)皿和Transwell中。 1.2 MSC增殖檢測(cè)：共培養(yǎng)7天后，利用Brdu免疫組織化學(xué)染色分析檢測(cè)各組中MSC增殖情況的改變。 1.3 MSC凋亡檢測(cè)：凋亡蛋白檢測(cè)(Caspase-3／7)：運(yùn)用Apo-ONE(R) Homogeneous Caspase-3／7 Assay試劑盒檢測(cè)。分別檢測(cè)對(duì)照組B與實(shí)

13、驗(yàn)組MSC的凋亡蛋白Caspase-3／7。 1.4 GLil mRNA定量分析：RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組B與實(shí)驗(yàn)組MSC的GLil mRNA定量。 2.Hh信號(hào)通路活性對(duì)MSC增殖與凋亡的影響 2.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組：MSC／HSC共培養(yǎng)體系中加A．20ug anti-Shh中和抗體，培養(yǎng)24h。 ②對(duì)照組：MSC／HSC共培養(yǎng)體系中加入無免疫源性的IgG抗體，培養(yǎng)24h。 2.2 Br

14、du免疫組織化學(xué)染色分析：觀察比較2組MSC增殖情況的改變。 3、HSC對(duì)MSC分化的影響 3.1實(shí)驗(yàn)分組 ①實(shí)驗(yàn)組：MSC／HSC共培養(yǎng)，孔徑0.4μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層，直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層，HSC和MSC以2x104的量分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ②陰性對(duì)照組：MSC／MSC共培養(yǎng)，孔徑0.4／μm的Transwell作為培養(yǎng)體系上層，直徑6cm的塑

15、料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)體系下層，MSC以2x104的量分別接種于培養(yǎng)皿及Transwell中。 ③陽性對(duì)照組：L-02人肝細(xì)胞株。 注：兩組培養(yǎng)基中均不加防止細(xì)胞分化的LIF。 3.2各組在共培養(yǎng)第7天行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；第14天行免疫熒光染色；第7天行PT-PCR檢測(cè)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 10.0 for Windows軟件處理，采用t檢測(cè)與方差分

16、析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、結(jié)果 1.與對(duì)照組相比， MSC／HSC共培養(yǎng)體系中MSC的增殖明顯活躍； MSC凋亡蛋白活性顯著降低； MSC的GLil mRNA定量明顯增加(p<0.05)。 2.與對(duì)照組相比，在MSC／HSC共培養(yǎng)體系加入anti-Shh中和抗體后， MSC的增殖受到明顯抑制(p<0.05)。 3.MSC／HSC共培養(yǎng)7天后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色提示MSC的AFP和CK18均為陽性

17、著色。L-02人肝細(xì)胞株為陽性對(duì)照。 4.MSC／HSC共培養(yǎng)14天后，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色提示MSC的AFP和ALB熒光染色均為陽性。 5.MSC／HSC共培養(yǎng)7天后，RT-PCR顯示MSC分泌肝細(xì)胞特征性蛋白AFP和ALB。 結(jié)論 1.MSC／HSC共培養(yǎng)體系中，Hh信號(hào)通路呈高度活化狀態(tài)：激活型HSC表達(dá)Hh信號(hào)通路蛋白(Shh)，MSC表達(dá)Hh信號(hào)通路受體Patched(Ptc)和Smoothen