Hedgehog信號調(diào)控杯狀細(xì)胞化生的效應(yīng)和機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　支氣管哮喘（哮喘）是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。Hedgehog（HH）信號通路在胚胎期發(fā)育和生后組織、器官的完整及功能的發(fā)育保持中起重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)急性肺損傷的修復(fù)不但與胎肺的發(fā)育過程類似，且修復(fù)過程中HH信號通路異常激活。杯狀細(xì)胞分布于氣道上皮細(xì)胞中，并參與構(gòu)成黏液纖毛清除系統(tǒng)而成為氣道的第一道防線，其化生引起的氣道黏液大量分泌是哮喘氣道重塑的重要特征之一，但

2、尚未見HH信號通路與杯狀細(xì)胞化生之間的相關(guān)報道。因此本課題主要研究HH信號通路在杯狀細(xì)胞化生中的作用和作用機(jī)制。
　　方法:
　　首先建立ICR雌性小鼠的哮喘模型，并用1mg/ml、3mg/ml和6mg/ml的Smo蛋白抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）進(jìn)行實驗性治療，初步了解抑制HH信號通路對哮喘的影響。為排除環(huán)巴胺致炎作用的干擾，我們將Smof/f小鼠的氣道上皮細(xì)胞接觸性敲除Smo基因，期望在不影響肺部炎癥的情況下，

3、了解HH信號通路對杯狀細(xì)胞化生的影響。敲除效率及敲除部位主要通過Smo蛋白的Western Blot和免疫組化來驗證，然后用上述實驗小鼠建立哮喘模型。計算支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的白細(xì)胞總數(shù)、分類計數(shù)評價肺泡炎癥的情況;采用組織切片HE染色和PAS染色及Muc5ac免疫熒光的方法測定肺組織炎癥浸潤和黏蛋白的情況;同時用免疫組化方法檢測小鼠肺組織Ptch1和Gli1的蛋白表達(dá)。體外實驗用Smo激動劑Purmorphamine誘導(dǎo)人支

4、氣管上皮細(xì)胞（HBE），通過qRT-PCR來評價上皮細(xì)胞Muc5ac、Spdef、 FoxA2和HH信號通路關(guān)鍵信號分子的mRNA水平改變。
　　結(jié)果:
　　(1)Smo蛋白抑制劑環(huán)巴胺實驗性治療哮喘:給藥組小鼠與模型組小鼠相比，肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)降低，肺組織的炎癥浸潤同樣是減輕趨勢（1mg/ml的環(huán)巴胺對炎癥無明顯影響）;給藥組Muc5ac、Ptch1和Gli1的蛋白水平與模型組相比總趨勢也是降低的，1

5、mg/ml的環(huán)巴胺可以顯著降低Muc5ac的合成。
　　(2)氣道上皮細(xì)胞敲除Smo基因后對哮喘的影響:采用氣道上皮Smo敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)哮喘模型組小鼠的炎癥細(xì)胞總數(shù)增高及肺部的浸潤明顯嚴(yán)重，而氣道上皮的Smo基因敲除后，炎癥情況沒有顯著性差異。Muc5ac的蛋白水平在哮喘模型組氣道上皮細(xì)胞中同樣明顯增高，基因敲除后表達(dá)量顯著性降低，與HH信號通路下游信號分子的變化趨勢一致。
　　(3)體外機(jī)制研究實驗:Smo激動劑能有